中华人民共和国农业农村部公告第号
根据《兽药管理条例》规定，我部组织制定了《兽药中非法添加四环素类药物的检查方法》等2项标准，现予发布，自发布之日起执行。??特此公告。??附件：
1．兽药中非法添加四环素类药物的检查方法
2．兽药固体制剂中非法添加酰胺醇类药物的检查方法
农业农村部
年11月19日
附件1
兽药中非法添加四环素类药物的检查方法
1适用范围
1.1本方法适用于麻杏石甘散、银翘散、替米考星预混剂、氟苯尼考预混剂、磺胺氯吡嗪钠可溶性粉中非法添加土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素或多西环素的检查。
1.2用于其他兽药制剂中非法添加土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素或多西环素等四环素类药物检查时，需进行空白试验和检测限测定。
2检查方法
照高效液相色谱法（《中国兽药典》一部附录）测定。
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.01mol/L草酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B，按下表梯度洗脱；二极管阵列检测器检测，采集波长范围为～nm，分辨率为1.2nm；记录nm波长处的色谱图。取土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素及多西环素对照品适量，用0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中各约含10μg的溶液，作为系统适用性溶液，取20μL注入液相色谱仪，同时记录光谱图和色谱图，出峰顺序依次为土霉素、四环素、金霉素、多西环素，相邻峰之间的分离度均应符合要求。供试品溶液中如有土霉素、四环素、金霉素或多西环素峰，与相邻峰的分离度应符合要求。
时间（min）
A%
B%
0
90
10
3
90
10
15
70
30
20
70
30
22
90
10
测定法取供试品1.0g，置锥形瓶中，加0.01mol/L的盐酸溶液ml，超声处理5分钟，摇匀，滤过，取滤液5.0ml，加0.01mol/L盐酸溶液稀释至25ml，摇匀，作为供试品溶液。另取土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素或多西环素对照品适量，用0.01mol/L的盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中各约含10μg的溶液，作为对照品溶液。取供试品溶液和对照品溶液各20μL注入液相色谱仪，同时记录色谱图和光谱图。必要时，可调整供试品溶液或对照品溶液的浓度，使两者峰面积近似。通过与对照品溶液色谱图保留时间、光谱图的比对，确定供试品中是否含有土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素或多西环素。
3结果判定
3.1供试品溶液色谱图中如出现与土霉素、四环素、金霉素或多西环素对照品保留时间一致的峰（差异小于等于±5%），且为单一物质峰；在规定的采集波长范围内，两者紫外光谱图匹配，且最大吸收波长一致（差异小于等于±2nm），判定为检出土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素或多西环素。
3.2供试品溶液色谱图中峰保留时间与土霉素、四环素、金霉素或多西环素对照品峰一致，但峰面积小于检测限峰面积，判定为未检出土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素或多西环素。
4检测限
本方法检测限土霉素、盐酸四环素为0.5g/kg，盐酸金霉素、多西环素为1.0g/kg。
附图1：四环素类药物混合标准溶液色谱图
注：出峰顺序依次为：土霉素、四环素、金霉素、多西环素
附图2：四环素类药物混合标准溶液光谱图
附件2
兽药固体制剂中非法添加酰胺醇类药物的检查方法
1适用范围
1.1本方法适用于兽药固体制剂（健胃散、止痢散、球虫散、胃肠活、阿莫西林可溶性粉、氨苄西林可溶性粉、硫酸新霉素可溶性粉、盐酸大观霉素林可霉素可溶性粉、盐酸土霉素预混剂、注射用盐酸土霉素、盐酸金霉素可溶性粉、酒石酸泰乐菌素可溶性粉、硫酸红霉素可溶性粉、替米考星预混剂、盐酸林可霉素可溶性粉、硫酸粘菌素可溶性粉、恩诺沙星可溶性粉、盐酸环丙沙星可溶性粉、氧氟沙星可溶性粉、盐酸环丙沙星小檗碱预混剂、阿苯达唑伊维菌素预混剂、阿维菌素粉、地克珠利预混剂、维生素C可溶性粉、复方维生素B可溶性粉）中非法添加的酰胺醇类药物（甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素）的检查。
1.2用于其它兽药固体制剂药物中非法添加酰胺醇类药物（甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素）检查时，需要进行空白试验和系统适用性试验，供试品溶液中甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素色谱峰与相邻的色谱峰分离度应符合要求。必要时可采用二极管阵列检测器进行峰纯度检测。
2检查方法
照高效液相色谱法（《中国兽药典》版一部附录）。
色谱条件与系统适用性用十八烷基键合硅胶为填充剂（WatersAtlantisT34.6mm×mm,5μm,或其他等效的色谱柱）；以甲醇为流动相A，以乙腈为流动相B，水为流动相C，流速为1ml/min，按下表进行洗脱；二极管阵列检测器检测，采集波长范围为nm~nm，分辨率为1.2nm，分别记录nm和nm波长处的色谱图。
时间（分钟）
流动相A（%）
流动相B（%）
流动相C（%）
0
13
12
75
12
13
12
75
26
0
40
60
30
13
12
75
35
13
12
75
分别取甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素对照品适量，加40%甲醇溶液超声使溶解，制成每1ml中各含约50μg的溶液，作为系统适用性溶液。取10μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图和光谱图。甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素之间的分离度应符合要求。
测定法取供试品约0.5g，精密加入40%的甲醇溶液50ml，超声15分钟，摇匀，转/分钟，离心5分钟；取上清液1.0ml置10ml量瓶中，加40%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。分别取甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素对照品适量，加40%甲醇溶液超声使溶解，制成每1ml中各含约50μg的溶液，作为对照品溶液。取供试品溶液和对照品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪，同时记录色谱图和光谱图。必要时，可调整供试品溶液或对照品溶液的浓度，使两者峰面积近似。通过与对照品溶液色谱图保留时间、光谱图的对比，确定供试品中是否含有甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素。
3结果判定
3.1供试品色谱图中如出现与相应对照品保留时间一致的峰（差异小于等于±5%），且为单一物质峰；在规定的采集波长范围内，两者紫外光谱图匹配，且最大吸收波长一致（差异小于等于±2nm），判定为检出为甲砜霉素、氟苯尼考或氯霉素。
3.2供试品溶液色谱图中峰保留时间与相应对照品峰相同，但峰面积小于检测限峰面积，判定为未检出甲砜霉素、氟苯尼考或氯霉素。
4检测限
本方法甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素检测限为4g/kg。
附图1：酰胺醇类药物混合标准溶液nm和nm色谱图
注：1、上图为nm色谱图，下图为nm色谱图；
2、出峰顺序为甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素
附图2：酰胺醇类药物混合标准溶液光谱图
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