陈波1，王宇1，雷芳2，尹业师2，王欣1,2
(1．浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华;
2．浙江省农科院植物保护与微生物研究所，浙江杭州)
体外肠道模型;微生态;连续发酵
R-33A
随着分子微生态学，特别是高通量测序技术的发展，人类对肠道微生物的作用有了新的突破性认识。我们现在了解到人体和动物消化道系统中生长着大量的细菌，肠道中细菌的总数量甚至高出人体细胞总数的十倍。肠道微生物的菌群多样性受到多种因素的影响。其中环境和宿主的遗传背景在决定肠道菌群结构和组成方面各自起到50%的作用。而且由于外部环境在肠道菌群结构形成过程中的巨大影响，个体之间肠道菌群结构和组成极为不同。目前的研究证明只有极少数的细菌存在于大多数人的肠道中。而个人之间菌群结构的不同反过来又直接影响到宿主的免疫系统发育和营养物质的吸收，甚至和自身免疫性疾病的产生相关。肠道微生物现在认为是人体的一个新“器官”。而肠道微生物生态的研究近十年来也受到了广泛的重视。但是肠道微生物研究存在的重要的瓶颈在于样品的采集。对正常人来说，除了收集粪便之外，小肠、升结肠、横结肠等部位的取样几乎不现实。另一方面，由于肠道细菌受到外部环境和宿主肠道环境的双重影响，如何区分外部环境和肠道内环境对肠道菌群的作用变得十分重要。所以，建立合理而易操作的体外模型对推动肠道微生态学、人体和动物营养学的发展非常有意义。本文就国内外目前经常使用的用于肠道微生态研究的体外肠道模型做一简单介绍。
1体外肠道模型的发展
1.1静止发酵或罐批量培养模型此模型为最原始、最简单的体外发酵模型。该发酵在小瓶子中或者pH控制的批量发酵罐中进行。具体做法为在批量发酵罐中接入动物肠内容物或人粪便菌群的悬浮液，培养基中含有不同的待测碳水化合物或蛋白质，整个发酵过程在充满氮气或二氧化碳的下进行。该模型简单、易操作，可以同时对多种底物进行比较，所以多用于对碳水化合物的初步筛选。缺点是只能用于短期的发酵研究，因为培养物内pH和营养物水平变化很快直接导致菌群的改变，导致该模型对肠道环境的模拟效果不理想[1]。而且，由于死亡的细菌不能及时从发酵系统中清理出去，如果采用分子生态学的检测手段，如荧光定量PCR或FISH等方法无法区别死亡细菌还是活细菌，所以该模型不适用于使用16SrRNA的分子生态学实验手段来测定菌群的变化，使用范围有比较大的局限性。但常规微生态学手段，如采用选择性培养基培养活细菌的方法还是能够测定菌群变化的。由于24h之后培养基中养分已被大量消耗，而发酵终产物不断累积，长时间培养结果离肠道实际内环境偏差很大GIBSON和FULLER报道用此模型进行研究在48h内结果还是比较稳定可靠的[2]。
1.2连续发酵培养系统食糜在人体和大部分单胃动物消化系统中按照口到肛门的单方向流动，所以肠道细菌在单胃动物肠道中的发酵可以看做是一种恒温连续发酵的过程。发酵工艺中连续发酵的特点和肠道发酵特点比较接近，所以通过恒化连续发酵工艺从理论上可以模拟肠道细菌发酵的自然过程。COATES等首先设计了连续发酵培养系统，在这个系统中可以连续的加入新鲜培养基同时移除使用过的废液。随着设计工艺和制造技术的不断发展，研究人员已经可以在体外控制这个连续培养系统的pH、温度、氧化还原能和营养状态等，来控制发酵罐中细菌的数量与菌群结构[3,4]。最原始的的连续培养是单相连续发酵模型。但由于大肠环境的复杂性及不同肠道位置的解剖结构和环境存在差异，单相连续发酵模型的局限性越来越明显，继而GIBSON和MACFARLAN[5,6]等根据人体结肠的生理特点建立了三相连续发酵模型，同时通过比较该模型中菌群的结构特点和突然死亡的人体肠道菌群的生理生化指标之间的相关性，对该模型的可靠性进行了验证。研究结果表明三相连续发酵模型能较好的模拟各个肠道解剖位置，即升结肠、横结肠和降结肠环境中肠道菌群的实际结构。现在常用的三相连续发酵系统由三个发酵瓶V1、V2和V3串联而组成，它们各自的容积分别为0.22、0.32和0.32升，分别代表升结肠、横结肠和降结肠的生理位置。根据人体肠道不同解剖位置的实际生理特点，三个罐的pH分别控制在5.5、6.2和6.8，整体温度控制在37℃。每个发酵瓶都用磁力搅拌器以一定速度进行搅拌以混匀培养基，同时充入无氧氮气，以维持发酵瓶的厌氧环境。
如图1所示，培养基从培养瓶依次流入V1，再从V1流入V2，V2流入V3，最后从V3流入废液罐中。其营养物质的流向和人体结肠中营养物质的流向相同。连续培养模型目前广泛应用在肠道细菌的生理、生化研究过程中。
1.3人类肠道微生态模拟器由于三相连续发酵模型仅仅模拟了人体结肠部位的肠道微生物生态过程，没有涉及胃和小肠的微生物。年，MOLLY等[9]设计了一个五相反应器，命名为人类肠道微生态模拟器。该模拟系统被认为能够全方位，更好的的模拟人体肠道内的微环境。如图2所示，该系统温度仍然保持在37℃。其中Vessell模拟的是胃环境，反应体积是0.2L，保留时间为2h，pH控制在2.0～2.5。
Vessel2系统模拟小肠部位，反应体积为0.3L，保留时间为6h，pH控制在5.0～6.0。Vessel3、Vessel4、Vessel5三相反应系统模拟升结肠、横结肠、降结肠部位，反应体积分别是0.7、1.3、0.8L;保留时间为18、36、22h;pH分别控制在5.5～6.0、6.0～6.4、6.6～6.9。因为模拟小肠的生理生化过程，该模型在Vessel2内通过蠕动泵添加含有水解酶的胰腺提取液。MOLLY等设计了含有阿拉伯糖、果胶、木聚糖、糊精、淀粉5种不同碳源的培养基研究不同营养组分对肠道菌群的影响。通过测定了菌群数量、挥发性脂肪酸、19种酶活性等数据和人体内数据相比较，发现数据之间比较吻合，证明了此模型能可以模拟人体肠道来研究微生物菌群互作和变化规律。此模型较之上述模型多了模拟食糜从胃到小肠的这个过程，更加接近人体正常生理学的过程。
1.4电脑控制发酵系统年，MINEKUS等介绍了一种新型的发酵系统，这种系统包括四个玻璃单元互相连接，其中每个单元中有一个灵活的壁。这个系统控制在37℃，然后通过电脑控制挤压玻璃单元内壁使得代谢物能够在四个单元间流动。系统内的微生物吸收水和代谢物质需要通过内置的中空纤维膜，食糜混合和运输则借助蠕动泵实现。这个系统在难消化食物成分和微生物的代谢及大肠肠道微生态方面研究上有重要的作用[11]。虽然此模型比以往模型更加自动智能化，但由于其系统挤压玻璃单元在设计和制造方面存在着一定的困难，尤其是中空纤维膜内置与电脑连接过于复杂，其应用并不太广泛。
1.5肠道微生物生态的非流动性发酵系统以上的大多数系统其细菌数目和细菌种类都存在一定的变异性，而且需要较长时间才能达到稳定状态。有的研究者认为这种不稳定性可能是由于随意的移去细菌细胞和培养基而导致的。由于是随意的移去细菌细胞和培养基，所以一些活的细菌细胞和未利用完全的培养基也被移除掉，而理想的情况是只移除死亡了的细菌细胞和已充分利用了的培养基。为了克服以上这些系统固有的困难和缺陷，CINQUIN等[12]年提出了一种新型的发酵模型。他们设计了一层膜，把来自婴儿粪便的微生物放到多糖基质上去发酵，这样既可以连续发酵又不移掉细胞来确保那些需要定植才能生长的细菌不被移除掉。从而增加了系统的模拟效果和稳定性。
2体外肠道模型的应用
2.1肠道微生态内细菌功能和多样性的研究正常人类肠道微生物的取样困难意味着肠道微生物研究必需做大量体外研究，这样肠道体外模型对于研究微生物对底物的反应过程非常有用。例如研究肠道细菌对碳水化合物和蛋白质的发酵利用，对类固醇和胆汁酸的代谢机制，氢的产生和去除，突变物的形成与降解以及异型代谢产物的转化等。另外通过体外模型可以进行单一或几种纯菌的培养研究，即把几种已知的细菌混合培养研究细菌之间的相互关系。根据研究者需要可以选择单相或者多相连续发酵系统。YIN等[13]成功利用单相体外模型得到两组稳定的、可重复的菌群并灌喂了雏鸡。其研究结果表明了不同菌群结构对小鸡回肠基因表达谱有显著的影响。LIN等[14]通过体外模型评估了膳食纤维对猪肠道内微生物发酵特性和菌群结构的影响，发现拟杆菌、厚壁菌等可使产丁酸的菌大量增加，短链脂肪酸也显著增加，进一步证明了膳食纤维对肠道的益生作用。
传统微生物研究认为，一种微生物对应一种疾病，现在有研究者认为，有些疾病并不是单一菌导致，可能是几种菌群共同作用的结果。所以，利用微生态理论，通过微生态模型能够研究疾病的发生和药物代谢治疗的原理。这个方面目前又引起了广大研究者的兴趣。另外，也有研究者利用体外模拟进行微机器人的研究开发，为开发治疗肠道疾病提供无创伤治疗方法提供了新的途径。
2.2体外模拟肠道抗生素对肠道菌群变化的药效研究很多功能食品组份或者抗菌类药物的前期开发过程中对人体肠道细菌结构的影响都是通过体外肠道模型来进行的研究。例如在低聚果糖和菊粉的开发中，首先是采用人类肠道微生态模拟器发现了菊粉可以成比例的增加肠道内丙酸、丁酸的含量，同时提高了肠道菌群中双歧杆菌的比例[15]。另外，采用多相连续发酵接种纯细菌后，添加鞘氨醇后发现，通常具有广谱抗菌作用，用来保护皮肤的鞘氨醇，在体外肠道模拟系统中对菌群不产生任何作用，说明在肠道中鞘氨醇可能被蛋白质或者长链脂肪酸或者其它物质给中和。ANTHONY等[16]通过连续发酵系统评估四环素对肠道菌群的影响，从这系统中筛选出一株耐药性乳酸菌。在哌拉西林三唑巴坦研究中，采用三相连续发酵系统研究发现这种抗生素可以抑制艰难梭菌的定植。在模拟系统中不使用哌拉西林三唑巴坦时，艰难梭菌定植能够大量繁殖。
2.3微生态制剂和益生素生产研究常规的微生态制剂生产都采用单一菌株、批量发酵的工艺。区别于传统发酵工艺，连续发酵采用连续补料不断出料的工艺，这样有效地避免频繁上罐，减少污染，降低生产成本，产品更加稳定可靠。而且体外模拟系统可以模拟肠道内环境，这样培养出的微生态制剂的生理生化特性更接近于细菌在人体肠道内的状态，更易于在体内定植。目前，国内已有个别企业运用这项技术进行微生态制剂的生产。影响微生态制剂发挥其功效的因素很多，包括制剂的制备方法、贮藏条件、污染情况(如杂菌)、细菌的存活率、产品的菌种组合方式、肠内土著菌群的状态、微生态制剂的使用剂量和次数、动物(宿主)的年龄、饲料的组分等。使用连续发酵的工艺在提高产品稳定性方面有很大的改进，经过临床试验表明，由此模型发酵得到的混合菌群能很好的动物肠道内定植。
WICHIENCHOT等[17]通过三相连续发酵从人体肠道样品中筛选出一株氧化葡萄杆菌(GluconobacteroxydansNCIMB)，能够大量产生寡聚葡萄糖。ANDERSON等[18]曾经报道使用来自健康猪的肓肠菌群，通过连续发酵系统生产成竟争排斥益生菌，用于刚出生的小猪。临床试验表明该产品可以提高其对霍乱沙门菌的抵抗力，在断奶时期小猪粪便内沙门菌的排出数量和在肓肠中的定殖量明显减少。而HARVEY等[19]也在体外模型中证明猪肓肠的连续发酵产品能够有效的抑制伤寒沙门菌、霍乱沙门菌、大肠埃希菌F-18和O:H7的定植。
3展望
3.1高通量测序技术对于体外肠道模型研究的促进作用
人体内共生的微生物多达多种，它们的基因总和称为“微生物组”，也被称为“人类元基因组”。随着测序技术的高速发展，特别是第二代高通量测序成功应用于元基因组学，QIN等[20]研究了个欧洲人(来自北欧和地中海民族，包含身体健康、超重或肥胖、患有肠道疾病的人群)的肠道菌群样品总DNA，利用IlluminaGA的测序方法，共获得万个非冗余人体肠道元基因组的参考基因集。发现人体肠道微生物的基因数量是人类自身总基因(2万多)的倍。虽然该基因集中包含了绝大部分已知的人体肠道微生物基因，但更多的是目前未知微生物的基因。最近，本实验室把高通量测序技术应用于体外肠道模型的稳定性和可重复性评估方面取得了令人满意的结果。进一步证明了体外肠道模型的可靠。高通量测序技术和体外肠道模型研究的结合能够使深入研究肠道复合菌群的代谢功能称为可能。
3.2利用体外肠道模型进行微生物的分离和克隆新的功能基因
元基因组测序研究结果表明，人体肠道内存在大量未培养细菌。而这些未培养细菌虽然不能在体外单独分离培养出来，却可以在体外模型中生长。进一步通过调节培养基组分或者流加速度，可以在体外模型中实现不同的未培养细菌的富集培养。结合高通量测序技术，有可能解决未培养细菌由于体内数量过于稀少而无法测序的难题，为研究这些未培养细菌的生理、生化特性，下一步的纯化培养提供了更能多的可能。
大片段文库技术是一种不依赖于微生物纯培养的方法调取功能基因的有效手段。BEJA等[21]从海洋细菌的元基因组文库中发现了一种以前只存在于真核生物和古生菌中的视觉光驱动蛋白。但是由于人体肠道中细菌分布的不均一性，低丰度的细菌的DNA样品较难获得，从而影响到了通过大片段文库技术筛选低丰度细菌特异基因的可能性。结合体外肠道模型对低丰度细菌的富集作用，建立大片段文库，可以预见在不远的将来能够挖掘出大量有特殊功能的，包括新型酶类、抗生素和其他有价值的活性物质在内的细菌基因。
4结语
体外肠道模型具有操作方便、重复性好、可量产和可调控等优点。由于人肠道内容物的获取非常困难，所以目前研究大部分使用非常接近人结肠内菌群结构的粪便作为体外发酵模型的起始菌群。MOLLY等设计了人类肠道微生态模拟器，能更好的模拟人体肠道内的微环境，为微生态学研究提供了新的研究手段。国际上许多学者已经利用体外肠道模型研究肠道菌群结构和功能，对各种食品药品的利用情况已经取得了许多成果，并且利用此发酵工艺已经应用到生产上，国内对于此领域的研究几乎空白，肠道体外模型在国内还有待进一步开发利用。
［1］COATESME，MALLETTAK，ROWLANDIR．Methodologicalcon-siderationsforthestudyofbacterialmetabolism［M］//ROWLANDIR．Roleofthegutfloraintoxicityandcancer．，London:AcademicPress，;-．
［2］GIBSONGR，FULLERR．Aspectsofinvitroandinvivoresearchap-proachesdirectedtowardidentifyingprobioticsandprebioticsforhumanuse［J］．JNutr，，(Suppl):S-S．
［3］MARSHPD．Theroleofcontinuouscultureinmodellingthehumanmicroflora［J］．JChemTechnolBiotechnol，，64(1):1-9．
［4］ILETTKF，TEELB，REEVESPT，etal．Metabolismofdrugsandoth-erxenobioticsinthegutlumenandwall［J］．PharmacolTher，，46(1):67-93．
［5］ALLISONC，MCFARLANC，MACFARLANEGT．Studiesonmixedpopulationsofhumanintestinalbacteriagrowninsingle-stageandmul-tistagecontinuousculturesystems［J］．ApplEnvironMicrobiol，，55(3):-．
［6］GIBSONGR，CUMMINGSJH，MACFARLANEGT．Useofathree-stagecontinuousculturesystemtostudytheeffectofmucinondissmila-torysulfatereductionandmethanogenesisbymixedpopulationsofhu-mangutbateria［J］．ApplEnvironMicrobiol，，54(11):-．
［7］MACFARLANEGT，MACFARLANES，GIBSONGR．Validationofathree-stage
