近日，湖南农业大学曾建国教授研究团队在鸡肠道参考宏基因集构建和抗生素与植物来源的天然促生长剂的促生长机制方面的研究取得了突破性进展。其研究成果以“Thechickengutmetagenomeandthemodulatoryeffectsofplant-derivedbenzylisoquinolinealkaloids”为题于年11月27日以长篇幅研究论文(ResearchArticle)的形式在国际微生物学权威期刊Microbiome(IF:11.)上在线发表。
图1.Thechickengutmetagenomeandthemodulatoryeffectsofplant-derivedbenzylisoquinolinealkaloids
文章解读自上世纪五十年代科学家发现亚治疗剂量的抗生素可作为动物促生长添加剂(Antibioticgrowthpromoters,AGPs)以来，抗生素被大量使用并为养殖业带来了极大收益，但同时也因助推耐药菌形成而对公共健康造成了严重威胁。从年起，欧洲全面禁止饲用抗生素的添加，年美国也禁止抗生素在饲料中用于促生长，并将其置于兽医临床监督下使用。紧随其后，中国也制定了“遏制耐药性计划”，将在年全面禁止使用饲用抗生素。因此，开发绿色安全的替代品变得非常重要和迫切。近年来，植物源天然促生长剂(Naturegrowthpromoters,NGPs)，如博落回提取物(Macleayacordataextract,MCE，血根碱与白屈菜红碱组分)等，作为饲用替抗产品逐渐进入人们的视野。目前含有博落回提取物的产品（Sangrovit?和“博落回散（美佑壮?）”）已畅销70多个国家和地区。然而，无论是AGPs还是NGPs其作用机制均尚不清楚。只有阐明饲用抗生素（AGPs）防病促生长机制，才能真正指导天然来源防病促生长的饲用替抗产品的开发。该基因集是继人类、小鼠、猪和狗的肠道微生物基因集之后的又一个动物肠道微生物参考宏基因集。鸡作为重要的畜禽动物，为人类提供了肉、蛋等廉价优质的动物蛋白质，但是目前关于鸡肠道微生物宏基因集的大规模研究还相对缺乏。近日，湖南农业大学曾建国教授研究团队在鸡肠道参考宏基因集构建和抗生素与植物来源的天然促生长剂的促生长机制方面的研究取得了突破性进展。其研究成果以“Thechickengutmetagenomeandthemodulatoryeffectsofplant-derivedbenzylisoquinolinealkaloids”为题于年11月27日以长篇幅研究论文(ResearchArticle)的形式在国际微生物学权威期刊Microbiome(IF:9.13)上在线发表（图1）。
此前曾建国与*三文团队在*瓜和博落回基因组及合成生物学有成功的合作研究，此次是再次联合*三文领导的中国农科院深圳基因组研究所，与樊伟研究员团队及中国农业大学呙于明教授团队取得了该成果，该研究于年首次启动，历时6年成功构建了鸡肠道微生物参考基因集并基于该基因集系统地对比研究了抗生素生长促进剂(金霉素,CTC)和植物来源的生长促进剂(博落回提取物,MCE)对鸡肠道微生物的影响。该成果是对动物肠道宏基因组学研究的重要补充，更为可喜的是为开发饲用抗生素替代品提供了“整肠、抗炎、促生长”技术的支撑基础。
论文背景解读抗生素生长促进剂(Antibioticgrowthpromoters,AGPs)的使用虽然为动物的健康养殖做出了巨大的贡献，但是自低剂量抗生素作为促生长剂使用以来，便伴随着细菌耐药性和超级细菌问题，对环境和公众健康产生了潜在的严重威胁。瑞典早在年就迈出第一步，宣布全面禁止抗生素用作饲料添加剂。随后，丹麦也陆续禁止了多种抗生素作为生长促进剂使用。年，欧盟全面停止使用所有AGPs。美国年起也禁止抗生素在饲料中添加用于促生长，而将其置于兽医监督之下。中国农业部也制定了《遏制细菌耐药国家行动计划（-）》，将在年全面禁止使用饲用抗生素。因此寻找“安全、有效、可控、成本低”的饲用替抗产品是目前全球研究的热点。有报道指出低剂量抗生素不会增加无菌鸡体重，因此人们推断抗生素促生长剂的作用与肠道微生物紧密相关。目前研究表明AGPs可能通过抑制亚临床感染、减少肠道微生物产生的生长抑制代谢物等达到促生长效果，但更深入的生长促进机制仍不清楚。只有阐明AGPs防病促生长机制，才能真正指导天然来源防病促生长的饲用替抗产品的开发。因此需要进一步研究以促进我们对AGPs的理解。
长期以来，植物源天然促生长剂，如含有博落回提取物的产品已作为抗生素的替代品被广泛地用于畜禽生产中，在中国年底成功批准，成为我国首个二类新中兽药药物饲料添加剂产品。临床试验证明，博落回散对猪、鸡、水产具有很好的抗炎、维护肠道健康与促进生长作用。博落回散的有效化学成分包括血根碱和白屈菜红碱，两者均属于一组具有抗菌和抗炎特性的苄基异喹啉生物碱。另外，与血根碱具有高度相似的分子结构的另一种苄基异喹啉生物碱-小檗碱（也称*连素），其通过调节肠道微生物群在临床上有效治疗痢疾和肠炎，我国科学家赵立平教授和蒋建东教授等对小檗碱的肠道调节以及降糖降脂等作用有深入研究。虽然以博落回提取物为基础开发的饲用替抗产品全球市场取得了骄人的成绩，但是其提高畜禽生产性能的相关机制的细节仍不清楚。
传统的16SrRNA基因分析仅提供了关于微生物组成的有限信息，而宏基因组测序技术的不断进步，已经为肠道微生物的功能研究提供了重要的技术支撑。近年来，通过对数百个样品进行大规模测序，已经逐渐建立了人、小鼠、猪和狗的肠道微生物宏基因集，每个基因集包含数百万个非冗余基因，为研究这套宿主共生“第二基因组”的功能奠定了基础。因此，为了更好的理解家禽肠道微生物的功能，并解释AGPs、NGPs与肠道微生物群相互作用关系，湖南农业大学曾建国教授带领的研究团队，联合中国农科院深圳基因组研究所樊伟研究员团队，以及中国农业大学呙于明教授团队，于年启动了鸡肠道宏基因组研究计划。经过6年的努力，构建了第一个鸡肠道微生物参考基因集，并深入分析不同肠段（十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结直肠）、不同饲养方法（散养鸡和笼养鸡）、不同日龄（1-42日龄）对肠道微生物群落与功能的影响。最后，系统地比较了金霉素（CTC）和博落回提取物（MCE）对肠道微生物菌群的的调节作用。这些结果揭示了CTC和MCE对肠道菌群的影响存在显着差异，表明MCE作为饲用抗生素替代产品在家禽养殖中的巨大潜力。
1.鸡肠道宏基因集与人和猪肠道宏基因集的比较图2鸡肠道宏基因集。
（a）鸡肠道图。前肠（十二指肠、空肠、回肠）和后肠（盲肠、结直肠）及其微生物密度。（b）来自个样品（总计）和来自*鸡（LY），白羽鸡（AA）和不同地区样本的检测基因数量的稀释曲线。
与之前人类、小鼠、猪宏基因集研究中选择粪便作为研究材料不同的是，该研究选择了更能代表肠道微生物的不同肠段内容物样本作为研究材料。研究人员从中国7个不同农场饲养的鸡的5个肠段（十二指肠，空肠，回肠，盲肠和结肠直肠）中采集了个肠道内容物样本（图2a），通过高通量测序共产生1.64Tb宏基因组数据（每个样本平均为3.31Gb）。基于N50长度为1.95kb的组装重叠群（contigs），鉴定了万个非冗余基因，平均开放阅读框（ORF）长度为bp。样品稀释曲线显示曲线已接近饱和（图2b），表明绝大多数鸡肠道微生物的基因已被包含于此基因集中。该基因集的大小和质量与人肠道宏基因集（万基因）和猪肠道宏基因集（万基因）相当，可为后续研究提供有用的参考基因集。通过成对比较，发现在基因序列水平上，超过80％的基因在各物种中都是独特的，并且鸡、人和猪三者的肠道微生物基因共有比例很低（~0.5％）。另外，鸡和猪的共有微生物基因（~0.8％）比鸡和人（~10％）或猪和人（~10％）的微生物基因少（图3）。使用CAMRA3进行分类，鸡肠道基因集中80.99％的基因可在总界水平上进行分类，其中细菌占已分类基因的98.95％，其余1％来自古细菌和真核生物。超过88％的细菌基因来自四个主要的门类，分别为厚壁菌门，放线菌，变形杆菌和拟杆菌。
图3.人、猪和鸡肠道宏基因集比较
（a）人、猪和鸡肠道宏基因集的基因序列比较。（b）存在于鸡，人和猪基因集中及其共有的KEGG直系同源组（KOs）的维恩图。
在人类和猪肠道基因集中，厚壁菌门和拟杆菌门占主导地位，变形菌门和放线菌门占比较小。在较低的分类水平上，基因集中25.97％和2.29％的基因能被注释到属和种的水平。其中产生短链脂肪酸（SCFA）的属，例如拟杆菌（Bacteroides），Blautia，Ruminococcus和Faecalibacterium，既是人类和猪肠道微生物的主要属，也是鸡肠道中相对丰度较高的属，表明这类肠道微生物在鸟类和哺乳动物中的重要性。之后，使用KEGG和eggNOG进行功能基因分类。结果显示，鸡的基因集尽管在基因序列水平上与人和猪的基因集存在巨大差异，但共有肠道微生物功能相似性很高。值得注意的是，聚糖生物合成和代谢的相关基因在人类和猪的肠道中相对丰度较高，而膜转运相关的基因(包括糖、脂质、肽和离子等底物摄取等相关基因)在鸡肠道中的相对丰度较高。膜转运相关基因的较高丰度可能是因为鸡肠道中的多种营养底物更容易被微生物直接利用。鸡肠道中异型生物质降解，萜类化合物和聚酮化合物代谢的基因也有较高的相对丰度，这与鸡肠道中放线菌相对丰度较高有关，放线菌具有分解有机物并产生各种天然药物、酶和生物活性代谢物的特点。
2.不同养殖模式对于鸡肠道宏基因组的影响鸡在散养模式（DHC和DGY）下肠道微生物多样性（Shannon指数）高于笼养模式（DHK，DSL和DST）（图4a）。此外，土壤菌群主要成分的放线菌在散养鸡中也比笼养鸡中更丰富（图4b）。散养鸡暴露于室外环境并与更多样化的微生物菌群接触，因而具有不同的肠道微生物组成。
图4.(a)五个地区组（DGY，DHC，DHK，DSL，DST）中基因、属、OG和KO水平的样本微生物多样性（Shannon指数）。(b)五个地区组（DGY，DHC，DHK，DSL，DST）的前肠样品中放线菌门的平均相对丰度。
3.鸡的前肠和后肠宏基因组的不同特点该研究选用40日龄以上的鸡，对个肠道样品（包含5个肠段）的宏基因组数据进行了分析。分析发现，前肠段（十二指肠、空肠和回肠）的微生物多样性大致相同，而后肠（盲肠和结直肠）的多样性也大致相同，但前后肠之间的差异较大，且后肠的多样性明显高于前肠。通过微生物相对丰度分布的分析，发现乳杆菌属是前肠中的绝对优势菌属。众所周知，乳杆菌属能为宿主提供营养，并防御机会致病菌。前肠核心属的共生网络分析表明（图5），在前肠中，乳杆菌能竞争性地抑制一些细菌，与这些细菌的相对丰度均呈负相关关系（图5a）。此外，一些短链脂肪酸（SCFA）生产菌，如梭状芽孢杆菌、丁酸杆菌和Faecalibacterium彼此呈现正相关，并在前肠形成了相对独立和稳定的网络结构（图5a）。而在后肠中，有19个属彼此正相关并形成大的中心共生网络（图5b），该中心网络包含了有益肠道微生物，并且具有抑制机会致病菌（埃希氏菌和肠球菌）的作用（图5b）。这些结果揭示了后肠中的微生物菌群比前肠更加多样化和复杂的特点。
图5.鸡的（a）前肠和（b）后肠的核心微生物属共生网络分析
KEGG功能分析表明，前肠中的微生物菌群在复制、转录、翻译的遗传信息处理，以及核苷酸和脂质代谢方面的相对丰度高于后肠；而后肠中氨基酸代谢、能量代谢和次级代谢产物的生物合成方面相对更高，这与大量微生物在后肠发酵产生多种代谢物（如氨基酸和SCFA）的现象一致。同时，该研究认为前肠中乳杆菌属的优势以及乳酸菌属的基因组特点，在很大程度上促成了前肠微生物组的特点和前后肠之间的功能差异。总之，前肠和后肠微生物组的分类和功能特征与鸡肠的形态和生理结构一致。
4.鸡肠道菌群的随日龄的变化和逐渐成熟过程为了研究肠道微生物群落的时间变化特点，该研究分析了白羽肉鸡（AA）和*鸡（LY）两个品种在5个日龄（1,7,14,28和42日龄）的样品。结果显示，雏鸡（1日龄）的肠道微生物样品间差异很大，并且与其他日龄明显不同（图6），反映了雏鸡刚开始与环境微生物接触，并开始建立肠道微生物的群落的状态。微生物菌群的发展变化会受到诸多因素（如饮食、饲料添加剂、宿主品种等）的影响。对于AA和LY鸡，NMDS图显示样品能大致按照不同日龄聚类成组，且在第28天和42组表现出更高的相似性(图6)。在整个生长试验中，厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门和放线菌门始终是前肠和后肠中的细菌，并且都表现出明显的随时间变化规律。例如，相对丰度最高的细菌门-厚壁菌门，在前肠中从第1天到第28天逐渐增加，然后保持相对稳定；而在后肠中，厚壁菌门从第7天到第42天缓慢减少。在前肠和后肠中，微生物代谢能力均在第28天达到最大值，此后大致保持稳定；但前肠中不同日龄的差异程度要大于后肠中的日龄差异程度。综上所述，早期对于鸡的发育和肠道微生物群的建立都至关重要。
图6.不同日龄的鸡肠微生物组的差异。（a）不同日龄前肠微生物群落的NMDS图。（b）不同日龄后肠微生物群落的NMDS图。
5.金霉素和博落回提取物对前肠微生物菌群的调控以促进动物生长的作用通过生长性能测试，比较CTC和MCE（低L、中M、高H3个剂量）作为低剂量饲料添加剂在*鸡（LY）和白羽肉鸡（AA）中的作用。结果显示博落回提取物中剂量组（MCE-M）的体增重增加和料肉比（FCR）降低的效果优于金霉素组，这一剂量也符合商业中推广的剂量，表明博落回提取物在促生长的效果上是优于金霉素的，这对于养殖业具有重要的意义。白羽肉鸡回肠中细胞因子相对表达量检测，表明CTC和MCE均能下调包括IL-4，IFN-γ和NF-κB在内的宿主细胞因子，表明两者均具有抑制宿主炎症和免疫应答的效果。
CTC和MCE对鸡肠道微生物的影响主要在前肠，而对后肠的影响较小。在前肠中，乳杆菌属是受MCE影响的主要属（图7a），并且乳杆菌属在前肠中的优势地位能被MCE进一步加强。已知乳杆菌属是一种有益的益生菌，可以产生维生素和有机酸等营养物质，还可以竞争性地抑制病原体，有利于宿主的健康。此外，通过“交叉喂养”（crossfeeding）机制，乳杆菌属产生的乳酸还可以被厌氧细菌用于产生丁酸，构成是肠细胞的重要能量来源并发挥抗炎作用。
图7.（a）CTC和MCE处理后前肠中微生物的变化。(b)金霉素组抗生素生物合成途径的相对丰度增加。（c）金霉素组的抗生素抗性基因（ARGs）相对丰度增加。
与MCE不同的是，CTC能显著增加链霉菌科微生物（Streptomyces和Kitasatospora）的相对丰度，而这两类微生物包括多种合成抗生素的细菌。进一步分析发现，在金霉素组中四环素、大环内酯类、II型聚酮类和克拉维酸（青霉素类抗生素的增效剂）的合成通路都显著增强（图7b）。除此以外，抗生素抗性基因（ARGs）也有所增加（图7c）。相比之下，博落回提取物组中均不会产生上述结果，进一步证明了天然植物来源的抗生素替代产品博落回提取物的安全性。这些发现为解释亚治疗剂量抗生素的促生长机制提供了新的视角。
通过分析MCE和CTC对肠道微生物功能的影响，发现两者都对脂质代谢有重要的影响，均能富集次级胆汁酸生物合成途径。已知宿主分泌的胆汁酸具有改变肠道微生物组成的抗菌活性；而经过微生物修饰而产生的次级胆汁酸可以促进脂肪吸收，并参与调节宿主的能量代谢和免疫系统。此外，CTC还增强了脂肪酸和不饱和脂肪酸的生物合成途径，该结果表明脂质代谢调节是抗生素生长促进剂的重要机制。而MCE则通过增强氨基酸和维生素的生物合成途径来促进鸡的营养吸收和生长（图8）。
图8.CTC和MCE对前肠微生物KEGG代谢途径的显著改变。
总结综上所述，本研究发现两种促生长剂均对鸡的前肠微生物起着重要的调节作用。博落回提取物(MCE)改善了鸡的生长性能并调节了前肠微生物菌群，其作用包括促进有益菌乳杆菌属的增加，以及增强氨基酸、维生素和次级胆汁酸的生物合成途径。乳杆菌属的增加，还能通过竞争性抑制病原菌的作用等，导致宿主炎症和免疫应答反应的减轻。而金霉素(CTC)则能促进肠道中的链霉菌科（Streptomyces和Kitasatospora）微生物，可能通过促进部分细菌的多种抗生素合成作用来达到调节肠道菌群的效果。此外，CTC对次级胆汁酸和脂质代谢也有重要的调控作用（图9），因而影响宿主的营养吸收。本项研究是动物生长促进剂机制方面的重要研究，为开发安全有效的饲用抗生素替代产品提供了重要的支撑。
图9.CTC和MCE调控肠微生物菌群促进动物生长的推测机制。
本项成果由多家单位合作完成，并获得了科技部十三五“中兽医药现代化与绿色养殖技术”国家重点研发计划的大力资助。湖南农业大学博士生*鹏、中国农业科学院基因组研究所张艳博士后、湖南农业大学博士生肖康鹏、中国农业科学院基因组研究所江帆博士后为论文共同第一作者。中国农业大学呙于明教授、中国农业科学院农业基因组研究所樊伟研究员、湖南农业大学曾建国教授为共同通讯作者。
专家点评张和平教授点评专家介绍
内蒙古农业大学张和平教授，男，博士、教授，博士研究生导师，年国家杰出青年科学基金获得；年入选“长江学者”奖励计划特聘教授；年入选“国家百千万人才工程”、并获“有突出贡献中青年专家称号”；年入选全国农业科研杰出人才；年入选国家“万人计划”科技创新领*人才。先后获“内蒙古自治区科学技术特别贡献奖”（年度），“何梁何利科技创新奖”（年）、农业部年度“神农中华农业科技奖—优秀创新团队奖”。
现任乳品生物技术与工程教育部重点实验室、农业农村部奶制品加工重点实验室、乳酸菌筛选与乳品发酵技术国家地方联合工程实验室负责人。
以第一作者或通讯作者在NatureCommunication、TheISMEJournal、Microbiome和MolecularandCellularProteomics等SCI收录期刊发表论文余篇。开发的多种益生菌菌株广泛应用与食品工业，医疗健康，动物养殖等领域。
点评
饲用抗生素的大量使用严重威胁公众健康，因此减少甚至禁止饲用抗生素的使用并寻找适宜的替代品已受到全球