其实从名字就能看出来，高通量qPCR方法就是同时做多个qPCR以达到同时对多种抗生素抗性基因(Antibioticresistancegenes,ARGs)进行定量的目的。
那么想要理解高通量qPCR方法的原理，首先就必须了解qPCR的定量方法。
常规的qPCR定量分为绝对定量和相对定量两种。
相对定量一般是用于测定不同样品间目的基因表达水平的变化，最后得到的结果是两个样品间目的基因表达水平的差异倍数。
而在环境ARGs的研究中，通常是使用绝对定量的方法对目的基因进行定量。
使用绝对定量的原因是环境领域的研究通常需要知道单一样本中确定的目的基因数量，而这一数值是相对定量无法得到的。
qPCR绝对定量的过程要比相对定量复杂一些，需要先构建已知目的片段拷贝数的标准质粒，之后绘制目的基因的标准曲线，最后对样品中的目的基因进行qPCR测定，通过标准曲线对样品中的目的基因进行定量。
具体的过程和原理大家可以看一下我之前的推文《荧光定量PCR之绝对定量》，强烈建议没有看过的朋友先看一下，对于后面的理解非常重要！！
绝对丰度和相对丰度通过绝对定量最后可以得到的数值是“单位样品中目的基因的拷贝数”，比如说每克土壤中目的基因有多少个，活者每升水中目的基因有多少个，这就是通常研究说所说的绝对丰度(Absoluteabundance)。
这里我们一定要明确一个问题，环境样品中的ARGs都是位于微生物细胞内不的，更准确的说基本上都是位于细菌中。
虽然有少量的游离态DNA会携带ARGs，但是这些游离的DNA也破碎的细菌细胞释放的。
而不同的环境样本中，细菌的数目是不可能完全相同的，有的甚至会差别很大。
因此，只使用绝对丰度来评估环境样品中的ARGs得到的信息是不全面的，特别是当样本间细菌数目差异比较明显时，绝对丰度得到的ARGs丰度差异可能只是由于样本间细菌数目的差异导致的。
这在判断ARGs是否会被特定因素富集，特别是在评估ARGs是否会发生水平基因转移时，会导致非常大的误差。
为了解决这一问题，科研人员又在绝对丰度的基础上引入了相对丰度(Relativeabundance)的概念。
相对丰度的计算需要在使用绝对定量对目的基因进行定量的同时还需要测定样本中细菌marker基因(通常为16SrRNA基因)的绝对丰度。
之后再将两者进行除法运算，就可以得到样本中每个16SrRNA拷贝数对应多少个目的基因的拷贝数，从而评估样本中平均一个细菌细胞内携带多少个目的基因。
PS：注意这个过程，当我们使用qPCR定量单个目的基因的丰度时，我们是首先获得绝对丰度，之后再得到相对丰度。
扩增效率刚才说到绝对定量需要先绘制目的基因的标准曲线，标准曲线有一个评判的参数就是扩增效率。
我们都知道PCR是一个成倍扩增的过程，理想条件下，每经过一个PCR循环，目的基因的数目就会增加一倍。
这个目的基因的增加情况就是扩增效率，也就是说理想状态下的扩增效率应该是%。
但是在实际的操作过程中，我们不可能将目的基因的扩增效率精准的控制在%，一般情况下要求标准曲线的扩增效率在90%-%之间就可以进行定量了。
扩增效率不足%很好理解，这里还是要说一下为什么有的时候扩增效率会超过%。
这是因为一般的qPCR都是使用SYBRGreen的方法，该方法所用的荧光物质是没有特异性的，只要识别到双链DNA就会发出荧光，因此在反应体系中的引物二聚体、剩余的模版DNA等等各种双链DNA都会产生多余的荧光，是的扩增效率高于%。
扩增效率的概念大家一定要理解，这个在后面讲高通量qPCR定量原理的时候需要用到。
高通量qPCR的定量原理高通量qPCR就是在一个qPCR反应中同时测定多个目的基因的丰度。
下面这个图是QIAGEN公司开发的一款ARGs高通量qPCR产品的示意图。
该产品以常规qPCR仪器上机的96孔板为基础，可以看到因为同时还要测定一些用于质控的基因，所以该产品只含有80多个目的基因。
在96孔板的固定位置，放入指定目的基因的引物和反应体系，之后只需要在每个孔中添加样本DNA，就可以上机同时对80多个ARGs进行定量。
由于每个孔中测定的目的基因是已知的，在qPCR运行完成之后，就可以根据每一个孔对应的Ct值计算样本中该目的基因的丰度。
这个产品的示意图看起来比较直观，但是因为是以96孔板为基础，所以包含的ARGs数目比较少。
其它高通量qPCR产品其实原理上是一样的，只不过是使用更高级别的qPCR仪器和专用的上样板，这种上样板每个孔所占的位置更小、孔的数目更多，因此就可以使开发的方法包含更多的ARGs。
这种含有更高ARGs数目的qPCR方法，通常需要专用的仪器和设备，并且使用机器人进行加样，没有设备的实验室是无法独立完成的。
高通量qPCR数据计算过程按照单个qPCR的计算过程，我们首先需要有高通量qPCR中每一个目的基因的标准曲线，之后根据每一个目的基因的Ct值对其进行定量。
精确的操作方法要求，样本定量和标准曲线要在一次qPCR运行中同时完成，但是由于高通量qPCR所包含的目的基因实在是太多了，同时运行肯定是不现实的。
因此在高通量qPCR方法开发的过程中，研究人员采用了一种变通的方式。
这里要涉及到刚才说的扩增效率的概念了。
研究人员在方法开发的过程中，会通过调整反应体系、引物、反应条件等，尽可能的使每一个目的基因标准曲线的扩增效率接近%。
在方法开发完成之后，研究人员会默认所有的目的基因扩增效率都是%，之后在样本测试完成后，使用下方的公式对每一个目的基因进行定量。
公式中第二个括号内的10/3就是代表扩增效率为%，不必理会具体的计算过程，知道这个就可以了，也不需要你去修改。
公式中第一个括号内的37为芯片的检测限，即qPCR芯片结果中，Ct值＞37的基因认为其未被检出。
该数值有人为确定，我见过31、32、33、35和37，具体怎么选择没有标准，但是不要超过37。
在使用该公式计算之前，首先要去除Ct值超过检测限的基因，同时该方法一般会同时对一个目的基因测定三个重复，去掉三个重复中有少于两个检出的基因，剩余的基因就可以使用Ct值用上方公式计算得到一个标准化的拷贝数。
??接下来的逻辑和单独qPCR不同了！！
单独qPCR是先获得绝对丰度，再获得相对丰度。
而高通量qPCR则是先获得相对丰度，再获得绝对丰度。
在高通量qPCR的方法中，一定会包含测定样本中细菌含量的基因(16SrRNA等），在我们得到了每一个基因的Normalizedcopynumber之后，就可以使用下方的公式得到样本中每一个目的基因的相对丰度。
获得绝对丰度有一点麻烦，首先你需要有一台常用的qPCR仪器，之后经过一些测试之后要证明这台仪器定量细菌16SrRNA的结果要与高通量qPCR所用仪器测定细菌16SrRNA的结果显著相关。
之后使用绝对定量的办法自己测定一下样本中细菌16SrRNA的绝对丰度，再用这个数值去乘刚才计算得到的每个目的基因的相对丰度，就得到目的基因的绝对丰度了。
??用高通量qPCR测ARGs送样的时候自己一定要留一份样本，不然真是追悔莫及??
通过以上步骤，我们就得到了样本中各种ARGs的绝对丰度和相对丰度，之后就是根据方法给出的参考对其进行一些归类统计，一般分为type和subtype两种。
Type就是ARGs对应的抗生素，比如四环素、磺胺、多药物抗性等等。
Subtype就是基因类型，比如tetC、sul1、tetX等等。
得到数据丰度表格之后就是各种常规的统计学分析了，分析方法就是那么些，其实和细菌群落组成的数据分析没有太大区别，大家自行尝试吧～～
扩展阅读高通量测序基础知识微生物群落数据分析教程抗生素抗性基因相关宏组学研究之“道”转录组测序技术和结果解读红皇后学术文献解读列表基本分子生物学实验PAST：最简便易用的统计学分析软件教程目录每天学习一点R系列微生物研究相关工具微生物研究投稿期刊简介预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇