与革兰氏阳性菌不同，革兰氏阴性菌在细胞膜外多了一层由脂多糖、磷脂和脂蛋白组成的外膜。因为这种独特的外膜结构能阻止大多数抗生素进入到革兰氏阴性菌的细胞内，从而造成革兰氏阴性菌难以被杀灭的现象。尽管已经发展了数代β-内酰胺类、喹诺酮类和其它种类的抗生素来解决革兰氏阴性病原菌耐药的问题，目医院感染的6种主要病原菌ESKAPE(Enterococcusfaecium,Staphylococcusaureus,Klebsiellapneumoniae,Acinetobacterbaumannii,Pseudomonasaeruginosa,andEnterobacterspecies)中仍有5种是革兰氏阴性菌。研究人员曾经从微生物天然产物中先后发现了链霉素、卡那霉素和四环素作为抗革兰氏阴性菌的药物，但过去50年来，并没有全新的抗革兰氏阴性菌药物获得上市批准，革兰氏阴性菌耐药性问题也越来越严重。我们通过抗菌活性筛选发现南极来源真菌P.chrysogenum的发酵产物具有很强的抗革兰氏阴性菌活性，便对其开展了次生代谢产物研究和生物活性评价。
P.chrysogenum分离自南极阿德利企鹅的积粪样品，由武汉大学彭方教授分离并作了种属鉴定。我们从该菌的察氏液体培养基发酵产物中分离鉴定了9个化合物(Fig.1)，发现化合物1(chrysonin)是具有苯并八元氮氧杂环的新骨架类型化合物，并首次发现化合物2b除具有Δ1,2顺式双键的同分异构体3，还存在一种新的内盐形式的异构体chrysomamide(2a)。化合物4和5是已知的xanthocillin类化合物，具有很强的抗革兰氏阴性菌活性和细胞*活性。从P.chrysogenum的10升发酵液中获得的化合物4重量为4.1克，约占总发酵产物重量的50%。说明南极来源的P.chrysogenum是一株可以高产xanthocillinX的资源型真菌。
Fig.1化合物1-9的化学结构
通过高分辨率质谱分析，化合物1的分子式为C13H18NO3，分子中有6个不饱和度。通过1H和13C-NMR数据分析，表明化合物1中存在的一个邻位二取代苯环和一个酰胺键会占去5个不饱和度，因此推测分子中可能存在一个环状结构来满足不饱和度总数为6的要求。化合物1的二维NMR数据揭示了化合物1是由一个邻位二取代苯环(Fig.2A,unitA)和一个脂肪链(Fig.2A,unitB)通过酰胺键和醚键组成的苯并八元氮氧杂环结构。化合物1的C6位是一个叔醇手性中心，因为旋光谱表明化合物1几乎没有光活性，提示化合物1可能是一个外消旋体。随后通过手性柱拆分化合物1获得了两个化合物1a和1b。1a和1b的一维NMR数据与化合物1一致，说明它们的平面化学结构相同，但它们的圆二色谱图在约nm处的Cotton效应相反，分别与6S-chrysonin和6R-chrysonin等两个对映异构体的TDDFT-ECD计算结果吻合。以上数据证实了化合物1是由6S-chrysonin(1a)和6R-chrysonin(1b)两个对映异构体组成的外消旋体(Fig.2B)。
Fig.2化合物1的关键二维NMR相关信号(A)与圆二色谱分析图(B)
化合物2的高分辨率质谱分析表明它的分子式为C9H9NO2，仔细检查化合物2的1H和13C-NMR数据后发现在它的图谱中存在两套数据，比例为1:2.8(2a:2b)。我们从化合物2的甲醇溶液中获得了少量晶体(Fig.3A)，X-ray单晶衍射分析表明晶体的化学结构为N-[2-trans-(4-hydroxyphenyl)ethenyl]formamide，为已知化合物。文献报道的N-[2-trans-(4-hydroxyphenyl)ethenyl]formamide的NMR数据与化合物2b的数据一致。我们还从P.chrysogenum的发酵产物中获得了化合物2b的Δ1,2顺式双键的同分异构体——化合物3。通过分析化合物2a的1H-NMR谱，发现2a的H-9位双峰信号和NH三重峰信号与2b和3的相应信号都不相同(Fig.3B)，提示2a是2b的另外一种形式的同分异构体。因为在化合物2b的化学结构中并没有发现手性碳原子的存在，研究人员提出了化合物2b在酰胺键上可能发生的两种互变异构途径(Fig.3C)。进一步对比分析化合物2a和2b的二维NMR数据(Fig.3D)，证明化合物2a是由2b通过routeB互变途径形成的一个新的内盐形式化合物。这是首次观察到酰胺键存在内盐形式互变异构的报道。
Fig.3(A)化合物2b和4(inDMSO)的晶体结构图；(B)化合物2a,2b和3的不同类型氢信号比较图；(C)生成化合物2a的两种可能途径；(D)化合物2a的关键二维NMR相关信号
我们对化合物1-9进行了抗菌活性、细胞*活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性评价。发现化合物4和5对多种革兰氏阴性菌如鲍曼不动杆菌等均有很强的抑制活性(Table1)。化合物4和5对四种肿瘤细胞株也显示了很强的抑制活性(Table2)。化合物7有一定的细胞*活性和较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，新化合物1和化合物2有中等的α-葡萄糖苷酶抑制活性。以上研究结果表明极地来源微生物作为一种新资源，可以帮助人们发现抵抗人类病原菌的天然产物。
Table1.化合物1-9的抗菌活性测定结果(MIC,μgmL-1)
Table2.化合物2,4-7的细胞*活性测定结果(IC50a,μM)
本文第一作者，中国科学院南海海洋研究所级博士研究生ImranKhan是中国科学院大学UCAS奖学金资助的国际留学生。共同通讯作者为张长生研究员和张海波副研究员。
文章信息：ImranKhan,HaiboZhang*,WeiLiu,LipingZhang,FangPeng,YuchanChen,QingboZhang,GuangtaoZhang,WeiminZhangandChangshengZhang*.IdentficationandbioactivityevaluationofsecondarymetabolitesfromAntarctic-derivedCCTCCM.RSCAdvances,,10,?