四环素(TET)是一种广谱抗生素，常用于动物疾病的防治、饲料添加剂等。然而，它在动物性食品中的残留和积累会对人体产生多种副作用。近日，湖南大学蔡仁团队构建了一种基于核酸适配体的DNA四面体探针，通过滚环扩增(RCA)实现了TET的超灵敏荧光检测，该研究发表在上，文章题目为“Aptamer-PendantDNATetrahedronNanostructureProbeforUltrasensitiveDetectionofTetracyclinebyCouplingTargetTriggeredRollingCircleAmplification”。
通讯作者：蔡仁
第一作者：ChengyiHong
通讯单位：湖南大学
如图，带有5’端修饰生物素的三条DNA链与一条含有TET适配体的DNA链通过孵育自组装形成DNA正四面体结构(Apt-TET)，随后通过生物素和链霉亲和素相互作用促进磁珠(Apt-TETMBs)的功能化。当TET存在时，适配体优先与TET结合，释放出引物链。经磁分离后，释放的引物链随后与磷酸标记的DNA探针杂交，并在T4DNA连接酶、phi29DNA聚合酶和dNTPs的辅助下触发RCA反应。最后，当检测探针加入到该体系中，形成双链DNA产物，再利用双链染料SYBRGreenI(SG)产生荧光信号。
图1：Primer-Apt-TETMBs检测TET原理
如图2所示，nm处TET的荧光强度在0.?10ng/mL范围内逐渐增加，表现出良好的线性关系，检测限为0.pg/mL。与之前的多种检测方法相比，该方法检测范围更宽，检测限更低。这可能是因为DNA四面体纳米结构为适配体提供了良好的空间取向，提高了其与TET的结合效率。
图2：Primer-Apt-TETMBs用于TET检测
同时，在相同实验条件下，作者选择了四环素类抗生素家族中的CTC,DOX和OTC作为干扰物质，验证了Primer-Apt-TETMBs探针用于TET检测的特异性。如图3所示，Primer-Apt-TETMBs只有在TET存在时才能产生强烈的荧光信号，而干扰物质在PBS缓冲液或真实样品中的信号与空白对照一致。结果表明，该检测方法具有良好的特异性。
图3：Primer-Apt-TETMBs检测TET的特异性
最后，为了评估该方法的实用性，采用加标回收率法测定鱼类和蜂蜜样品中的TET含量。如图所示，随着TET浓度增加，鱼和蜂蜜样品中的荧光信号逐渐增强，荧光强度同TET浓度间的线性关系与缓冲溶液体系中二者间的关系相似。鱼和蜂蜜中TET的检出限分别为0.和0.pg/mL，均低于已有报道的检出限，表明该方法可用于实际样品的TET检测。
图4：实际样本中TET的检测
综上，本论文构建了一种基于核酸适配体的DNA四面体探针，通过RCA反应实现了TET的超灵敏荧光检测。该方法以DNA四面体纳米结构为基础，具有可控制的密度和空间取向，在TET的超灵敏检测方面具有很大的潜力，为解决食品安全问题提供了新思路。
参考文献：
Aptamer-PendantDNATetrahedronNanostructureProbeforUltrasensitiveDetectionofTetracyclinebyCouplingTarget-TriggeredRollingCircleAmplification[J].ACSAppliedMaterialsAndInterfaces,,13(17):-.
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