中华消化杂志,,41(6):-.齐尔旋,周丽雅.
摘要
目的评价阿莫西林和克拉霉素的耐药性对H.pylori根除率的影响，并探究阿莫西林和克拉霉素的最佳最小抑菌浓度(MIC)折点。
方法回顾性分析年3月至年12月因H.pylori阳性，采用标准三联疗法根除H.pylori的患者，最终纳入例H.pylori感染者，其中12例无根除治疗结果。治疗结束8~12周后，分别采用意向性治疗(ITT)和符合方案人群(PP)分析计算和例H.pylori感染者的H.pylori根除率，分析阿莫西林和克拉霉素耐药与H.pylori根除失败的关系，以及不同MIC折点判断阿莫西林和克拉霉素耐药与H.pylori根除失败的关系。统计学方法采用二分类logistic回归分析和一致性检验。
结果ITT和PP分析标准三联疗法患者的H.pylori根除率分别为66.4%(93/)和72.7%(93/)，95%CI分别为59.3%~74.3%和65.6%~79.7%。二分类logistic回归分析结果显示，阿莫西林耐药(OR＝6.，95%CI1.~36.,P＝0.)和克拉霉素耐药(OR＝10.，95%CI4.~28.，P0.01)均为H.pylori根除失败的独立危险因素。一致性检验结果显示，阿莫西林MIC折点为0.mg/L时，阿莫西林耐药与H.pylori根除失败的相关性最高(一致性一般，P0.05)；克拉霉素MIC折点为2.mg/L时，克拉霉素耐药与H.pylori根除失败的相关性最高(一致性中等，P0.05)。
结论标准三联疗法的H.pylori根除率已降至80%以下。H.pylori根除率下降与阿莫西林、克拉霉素耐药有关，二者在体内的最佳MIC折点分别为0.和2.mg/L。
H.pylori感染已成为世界性难题，全球自然人群感染率已达50%[1]。随着抗生素耐药性的不断增高，H.pylori根除疗效降低，标准三联疗法治疗H.pylori感染的疗效在世界许多地区并不理想[]。阿莫西林、克拉霉素和甲硝唑是标准三联疗法中常用的抗生素，有研究证实H.pylori对克拉霉素和甲硝唑耐药是含这2种药物方案根除失败的主要因素[]。有研究认为阿莫西林耐药率普遍较低，其对根除方案的影响尚不明确[]。有研究则认为随着对阿莫西林耐药的H.pylori菌株越来越多，未来阿莫西林耐药可能成为导致根除失败的一个重要因素[]。
微生物对抗生素耐药性的评价一般采用体外药敏试验，抗生素的最小抑菌浓度(minimalinhibitoryconcentration，MIC)是判断耐药与否的标准。目前常用的MIC折点参考美国临床实验室标准委员会(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute，CLSI)和欧洲抗菌药物敏感性试验委员会(EuropeCommitteeonAntimicrobialSusceptibilityTesting，EUCAST)制定的标准[]，其主要适用于单一抗生素治疗常规细菌的评价，而用单一药物评价的实验室标准可能不准确，且折点是基于独立于临床治疗方案的流行病学界值(epidemiologicalcut-offvalue，ECOFF)设定的，其检测的结果常低于临床折点[]。鉴于H.pylori体外药敏试验与临床根除疗效存在差异，本研究通过回顾性分析评价在标准三联疗法中阿莫西林和克拉霉素的耐药性是否对H.pylori根除率产生影响，并探究阿莫西林和克拉霉素的最佳MIC折点。
对象与方法一、研究对象回顾性分医院、医院、华中科技大学同医院、第二医院消化内科在年3月至年12月共同合作的一项有关标准三联疗法根除疗效的随机、多中心试验[]中的H.pylori感染者资料，均采用标准三联疗法(埃索美拉唑20mg+阿莫西林1mg+克拉霉素mg，2次/d，疗程为10d)治疗。纳入标准：①年龄为18~75岁；②因消化不良行胃镜检查；③H.pylori快速尿素酶试验(rapidureasetest，RUT)和Warthin-Starry染色呈双阳性；④既往未接受H.pylori根除治疗；⑤愿意参加并能配合本研究。排除标准：①纳入本研究前4周内接受过PPI、H2受体阻滞剂、铋盐或抗生素等治疗；②胃肠道恶性肿瘤病史；③胃或食管手术史；④患有胃泌素瘤；⑤患有严重的心血管、呼吸、血液、肾脏、肝脏或神经系统疾病；⑥处于妊娠或哺乳期；⑦对本研究药物过敏[]。最终共纳入例H.pylori感染者，其中12例(包括6例拒绝治疗、3例失访、3例依从性差)无根除治疗结果。本研究通过北京大学医学部独立伦理委员会审核批准(IRB010520709)，并按照赫尔辛基宣言的伦理指导原则和良好的临床实践进行，每例患者均签署知情同意书。
二、研究方法1．H．pylori感染确诊与根除率计算：例H.pylori感染者均行胃镜检查，自胃窦部取1块胃黏膜标本，使用胃H.pylori诊断试剂(福建三强生物化工股份有限公司)进行RUT检测。若RUT呈阳性，在患者胃窦部和胃体部再各取2块胃黏膜标本，用于Warthin-Starry染色、H.pylori培养和药敏试验，RUT和Warthin-Starry染色均呈阳性则确诊为H.pylori感染。所有患者治疗结束8~12周后，行13C尿素呼气试验(ZHP-型13C呼气质谱仪购自北京中科科仪技术发展有限责任公司；13C尿素胶囊购自深圳市中核海得威生物科技有限公司，每粒含13C标记尿素75mg)，结果阴性被认定为H.pylori根除成功。分别采用意向性治疗(intention-to-treat，ITT)和符合方案人群(per-protocolpopulation，PP)分析，计算和例(已排除12例无根除治疗结果的患者)H.pylori感染者的H.pylori根除率。
2．患者临床资料分析：比较根除成功和根除失败患者的临床相关因素，包括患者年龄、性别、BMI、是否吸烟、是否饮酒、内镜下诊断是否为消化性溃疡，以及对阿莫西林和克拉霉素是否耐药等。
3．抗生素MIC：从患者胃黏膜样品中分离出H.pylori菌株，在37℃高湿度微需氧条件下，在Karmali培养基中培养48~72h后观察菌株生长情况。将E-test试纸条(法国生物梅里埃公司)以放射状均匀贴在培养基表面，读取抑菌环和E-test试纸条交界处的数值，即MIC。分析阿莫西林和克拉霉素耐药性，以及不同MIC折点判断其耐药性与H.pylori根除失败的关系。
4．随访：治疗结束后1~3d随访，评价患者的依从性和不良反应。通过服用药丸计数判断患者依从性，服用药丸计数≤80%治疗药物的患者被认为依从性差。
三、统计学方法应用SPSS24.0软件进行统计学分析。呈正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用配对t检验。计数资料以例数和百分数表示，组间比较采用卡方检验。采用二分类logistic回归分析研究标准三联疗法中阿莫西林和克拉霉素耐药与H.pylori根除失败的关系，以OR值表示各变量与根除结果的关联性，OR值越高表示关联性越大。采用一致性检验分析标准三联疗法中不同MIC折点判断阿莫西林和克拉霉素耐药性与H.pylori根除失败的关联性，以Kappa系数评估一致性，Kappa值为0.~0.表示一致性极低，0.~0.表示一致性一般，0.~0.表示一致性中等，0.~0.表示一致性高，≥0.表示几乎完全一致。P0.05为差异有统计学意义。
结果一、标准三联疗法的根除率ITT和PP分析标准三联疗法患者的H.pylori根除率分别为66.4%(93/)和72.7%(93/)，95%CI分别为59.3%~74.3%和65.6%~79.7%。
二、标准三联疗法H.pylori根除成功与失败患者的临床相关因素比较与H.pylori根除失败患者比较，根除成功患者的临床相关因素中仅是否对克拉霉素耐药比较差异有统计学意义(χ2＝25.,P0.01)，年龄、性别、BMI、是否吸烟、是否饮酒、内镜下诊断是否为消化性溃疡、是否对阿莫西林耐药比较差异均无统计学意义(P均0.05)。见表1。
三、阿莫西林和克拉霉素耐药性与H.pylori根除失败的关系以年龄、性别、BMI、是否吸烟、是否饮酒、内镜下诊断是否为消化性溃疡、是否对阿莫西林耐药、是否对克拉霉素耐药为自变量，以H.pylori根除失败与否为因变量，采用二分类logistic回归模型进行分析，发现阿莫西林耐药菌株根除失败的风险是敏感菌株根除失败的6.倍，克拉霉素耐药菌株根除失败的风险是敏感菌株根除失败的10.倍，阿莫西林耐药(OR＝6.，95%CI1.~36.，P＝0.)和克拉霉素耐药(OR＝10.，95%CI4.~28.，P0.01)均为H.pylori根除失败的独立危险因素；年龄、性别、BMI、是否吸烟、是否饮酒、内镜下诊断是否为消化性溃疡均与H.pylori根除失败无关(P均0.05)。
四、不同MIC折点判断阿莫西林耐药性与H.pylori根除失败的关系一致性检验结果显示，阿莫西林MIC折点为0.mg/L时，在克拉霉素敏感+克拉霉素耐药患者、克拉霉素敏感患者和克拉霉素耐药患者中的Kappa值最高，分别为0.、0.和0.(一致性一般)，结果均有统计学意义(P均0.05)。提示阿莫西林MIC折点为0.mg/L时，阿莫西林耐药性与H.pylori根除失败的相关性最高。见表2。
五、不同MIC折点判断克拉霉素耐药性与H.pylori根除失败的关系一致性检验结果显示，克拉霉素MIC折点为2.mg/L时，在阿莫西林敏感+阿莫西林耐药患者、阿莫西林敏感患者中的Kappa系数均最高，分别为0.和0.(一致性中等)，结果均有统计学意义(P均0.05)；阿莫西林耐药患者较少，结果无统计学意义(P0.05)。提示克拉霉素MIC折点为2.mg/L时，克拉霉素耐药性与H.pylori根除失败的相关性最高。见表3。
六、患者依从性和不良反应的发生情况例患者中，3例(2.1%)依从性差，无药物不良反应事件发生。
讨论H．pylori的根除率随着抗生素耐药性的升高而降低，早年提出的标准三联疗法的H.pylori根除率已降至80%以下[]，不能满足高耐药的现状下根除H.pylori的需求。然而，在克拉霉素耐药率15%或已经证实标准三联疗法的H.pylori根除率85%的地区，疗程为14d的标准三联疗法可作为限制性推荐使用[]。本研究回顾性分析了4家医院10年前的标准三联疗法H.pylori根除疗效，克拉霉素耐药率为41.4%(53/)，ITT和PP分析H.pylori根除率分别为66.4%(93/)和72.7%(93/)，均已降至80%以下。在我国早已不推荐标准三联疗法作为一线的治疗方案，而是将含铋剂的四联疗法作为根除H.pylori的首选[]。
本研究结果显示，阿莫西林和克拉霉素耐药是H.pylori根除失败的独立危险因素，国内外学者也得出了相同的结论。我国台湾一项研究系统分析了含阿莫西林根除方案的5项随机试验，包括年至年共例患者，meta分析结果显示，阿莫西林的耐药性与根除失败风险的增加有关，阿莫西林耐药性是根除失败的独立危险因素[]。日本一项有关阿莫西林耐药性对H.pylori根除率影响的研究发现，阿莫西林MIC为0.04~1.00mg/L时，H.pylori菌株逐渐增多，提示未来对阿莫西林耐药的H.pylori菌株越来越多，可能是导致根除失败的一个重要的因素[]。Zhou等[]阐述了克拉霉素耐药性是根除失败的主要原因。年，WHO将对克拉霉素耐药的H.pylori列为需开发新疗法的16大病原体之一。越来越多的H.pylori对克拉霉素、甲硝唑等药物产生耐药性，这在很大程度上削弱了这些重要的抗生素在经验性根除治疗中的作用[]。
经验性治疗存在困难，而基于H.pylori对抗生素的耐药性检测结果选择治疗方案可以提高根除治疗的有效性[]。长久以来，MIC折点作为微生物活性的标准化度量值[]，一直是H.pylori体外药敏试验判断其是否耐药的标准。然而，体外培养的细菌生长条件与体内的环境显著不同，不能或不应直接预测总体细菌反应[]。本研究通过分析抗生素耐药性与H.pylori根除失败的一致性，得出与临床H.pylori根除结果一致性最佳的阿莫西林和克拉霉素的MIC折点分别为0.和2.mg/L，区别于均为1.mg/L的原始折点[]，间接证实H.pylori体外药敏试验测得的MIC折点与实际体内抗生素最佳MIC折点存在差异。
我国台湾一项关于阿莫西林的MIC折点合理性的研究，经抗生素耐药性与根除失败的一致性分析得出阿莫西林的MIC在0.mg/L时为最佳折点，区别于1.mg/L的原始折点[]。Hsieh等[]参与了一项有关H.pylori补救治疗的研究，对抗生素MIC折点进行了探讨，将对甲硝唑、克拉霉素、左氧氟沙星耐药的69例H.pylori根除失败的患者，分别采用MTBP(甲硝唑、四环素、铋剂和PPI)和ATBP(阿莫西林、四环素、铋剂和PPI)方案行二次根除治疗，经ROC曲线预测根除结果，结果显示在H.pylori补救治疗中，阿莫西林、四环素的最佳MIC折点分别为0.和0.mg/L，而原始折点分别为0.和1.mg/L。
H．pylori的根除治疗与传统的抗感染治疗存在不同。H.pylori存在于上皮细胞表面，在胃酸的特殊环境下，根除治疗需要与抑酸药物联用，并且通常采用多种抗生素联合的根除方案。因此评价H.pylori对抗生素耐药时，用单一药物评价的实验室标准是不准确的。可能影响体内抗生素MIC折点的因素如下。①抑酸药物与抗生素间的相互作用。Scott等[]提出阿莫西林在胃酸条件下不稳定，可能影响根除结果。有效抑制胃酸可防止阿莫西林在胃内分解，从而增加其生物利用度和血药浓度，提高根除率[]。Pedrazzoli等[]发现奥美拉唑浓度的升高可能会导致克拉霉素转移到胃液中的浓度增高，这可能有利于根除H.pylori。可见抑酸药物对于根除疗效的重要性。②抗生素之间的相互作用。目前多采用抗生素联合治疗的根除方案，一般应用≥2种抗生素的组合，多种抗生素的组合对各自的耐药折点是否有影响的相关研究尚不多见。Liou等[]一项纳入例患者的应用含铋剂四联疗法根除H.pylori的大型、随机临床试验中，多重回归分析结果显示，H.pylori的根除率仅受患者依从性的影响，与抗生素的耐药性无关。由此可见，多种药物的联合应用能在很大程度上克服H.pylori对抗生素的耐药性。
作为使用单一抗生素与抑酸药物联合的大剂量二联疗法，在现阶段作为一线和补救的根除方案得到越来越多学者的青睐。在含阿莫西林二联疗法中，是否也存在着阿莫西林的MIC折点变化？首先，阿莫西林为时间依赖型抗生素，其杀菌作用关键在于血药浓度高于MIC的时间占给药间期的百分比。与常规的2次/d给药方案相比，4次/d的给药方案延长了阿莫西林血药浓度占MIC的百分比时间，杀菌效果更好[]。其次，阿莫西林的杀菌作用与胃内pH值有关，随着pH值的升高，阿莫西林具有更高的稳定性和更低的MIC[]。因此，高剂量的PPI与高剂量的阿莫西林相互作用势必会影响胃内阿莫西林的MIC。最后，抗生素MIC折点随时间和耐药影响逐渐变化。韩国一项跨度16年的有关H.pylori多种抗生素MIC的研究发现，阿莫西林的MIC有上升趋势[]。我国台湾一项有关儿童抗生素耐药性变化的研究发现，年至年、年至年抗生素的MIC均有所升高，尤其是克拉霉素和甲硝唑的MIC均明显升高，且耐药率增高[]；年至年，从韩国汉城汉族人群中分离出的H.pylori菌株发现，阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、四环素的MIC持续升高[]。上述证据表明H.pylori对抗生素耐药的MIC折点逐渐升高，但CLSI并没有随着微生物耐药的变化对MIC值做出相应调整。查阅EUCAST近10年的资料，自年起对H.pylori耐药折点进行设定，年EUCAST仅将阿莫西林的MIC值从0.mg/L上调至0.mg/L，其余抗生素的MIC折点无变化，一直沿用至今[]。在高耐药和抗生素MIC折点变化的背景下，只有两大国际标准对抗生素MIC参考系统均做出相应调整，才能更好地指导临床用药。
综上所述，本研究结果显示阿莫西林临床最佳MIC折点为0.mg/L，符合EUCAST设定的阿莫西林的MIC折点。有研究证实克拉霉素的获得性耐药相对稳定[]，在H.pylori的体外药敏试验测得的耐药性等同于体内耐药性[]。本研究结果显示，克拉霉素临床最佳MIC为2.mg/L，该变化可能与克拉霉素在体内的药物相互作用有关。MIC折点不仅影响菌株对抗生素耐药，同样也会影响H.pylori根除结果，MIC折点越高，根除成功率越低[]。结合H.pylori的体外药敏试验采用相应的根除方案，在临床中有一定的指导意义，但也需重视抗生素MIC折点在体内的变化带来的影响。随着耐药机制和细菌菌群分布不断变化，以及人们对临床药理学参数的认识不断加深，针对不同的感染类型、人群和给药模式，探讨并优化抗生素MIC折点，为选择最佳治疗方案提供了新的思路，对获得高H.pylori根除疗效有着重要的意义。
本研究的局限性如下：①本研究以10年前的数据展开分析，不排除在此期间进行的根除治疗过程中，H.pylori耐药产生变化，故此本研究得出的最佳MIC折点仅作为临床工作的参考；②本研究的样本量偏少，且缺乏药理实验作为基础，可能对结果产生一定的影响，后续可进一步扩大样本量并结合药理实验，增加研究结论的信服力。
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