摘要
四环素类抗生素是应用最为广泛的广谱抗生素之一，它们在临床上的使用已超过60年。它们的结构多种多样，但其D环中的α,β-不饱和酮结构是较为保守的。除了光神霉素类化合物，它们是由四环素中间体经过氧化开环得到的，四环素D环的α,β-不饱和酮结构是较少被修饰的。上海有机化学研究所唐功利课题组在年发现了一系列非典型的四环素类化合物（4-11），它们的D环被不同程度地还原。近期，该课题组成功解析了高度还原D环的生物合成途径，并且通过同位素标记实验对酶催化机制进行了一定的阐释。
内容
首先，作者发现TjhO5可以成功将底物15转化为两个新的产物，这两个化合物虽然质谱数据与所推测的产物4相同但保留时间并不相同。为了进一步探究该反应，作者通过大量酶活测试成功分离得到其中的主要产物16，并鉴定了16的化学结构。16的ABC环与15相同但其C-10的羰基被还原为CH2，而且C-7位羟基构型发生了翻转。该结果说明形成最终的产物应该需要更多的酶参与后续的还原反应。
通过生物信息学分析，作者认为还原异构酶TjhD4很可能是参与后续反应的酶。体外初步酶活测试发现TjhD4确实可以将中间体16转化为D环完全还原的产物8和17。但是8和17均为野生型菌株发酵液中的次要产物，在该酶活体系中并未检测到主要骨架4。有趣的是，作者在TjhD4和TjhO5的一锅法体外酶催化实验中成功检测到了微量的产物4，且4的产量随着TjhO5的减少大幅度提升。该结果表明，只有TjhO5和TjhD4同时存在时才可以产生4，且过量的TjhO5可能会消耗4。接下来作者将TjhO5与化合物4孵育，发现TjhO5确实可以将4进一步还原为8和17。
上述实验结果表明，从15到完全还原的8和17可以经过两个不同的生物合成途径（A和B）。途径A中TjhO5可以还原16的C-10位羰基且催化C-7位羟基构型反转得到中间体16，16可以被TjhD4进一步还原异构为8和17。途径B中TjhO5和TjhD4共同还原15可得到4，4再经过TjhO5的还原得到最终的化合物。
为了进一步探究酶催化的机制，作者用不同的葡萄糖脱氢酶的循环体系确定了TjhO5和TjhD4分别作用于C-10位和C-8位。接下来，在HO和D2O实验中，作者发现A和B途径的酶催化机制并不相同，而且TjhO5还原羰基过程中存在一种特殊的脱氧机制，其C-10位脱氧可能是通过氧转移来实现的。
总结
作者在体外成功解析了四环素类化合物D环的还原性修饰。该多步还原过程需要TjhO5和TjhD4两个酶的共同参与。TjhO5首先还原15的羰基形成18，当TjhD4不存在时，TjhO5再次还原18形成16；16可被TjhD4转化为最终的化合物8和17。在这一过程中，TjhO5可以单独实现羰基的还原，羟基的脱除以及异构三个步骤。而TjhD4与TjhO5同时存在时，18则会立刻被TjhD4转化为4，4再最终被TjhO5还原为最终化合物。该工作可能对未来的生物催化，还原酶的功能预测，基因组挖掘等有一定的启示性。
本文通讯作者为中国科学院上海有机化学研究所唐功利研究员，第一作者为上海有机化学研究所助理研究员聂秋玥。该工作得到国家自然科学基金委和科学院先导B等项目的支持。
本文转自:"遇见生物合成"