近日，中国农业大学许文涛教授团队在中文核心期刊《生物技术通报》年3月刊发表题为《四环素双价适配体非酶免标记传感器》的封面文章。该研究设计了一种新型四环素双价适配体非酶标记传感器，以硫*素T（ThT）荧光信号变化的形式响应检测结果，实现了在20min内对牛奶样本中四环素的快速超灵敏检测，且特异性良好。
四环素（TC）作为广普性抗生素，在畜产养殖业中常因使用不当或滥用致使奶乳制品中出现抗生素残留，对人类健康造成严重威胁。传统检测方法如色谱，酶联免疫分析等，对仪器依赖性较强，且检测体系复杂、时间较长，不能很好地满足现场快速检测需求，因此，开发一种简单、快速、灵敏、低成本的四环素传感器是有意义和创新性的。
封面说明：蓝紫色核酸链象征着对四环素具有良好识别作用的适配体，在不存在靶标的情况下，透明液滴内包裹的硫*素T（ThT）可被适配体构象诱导实现荧光激发；当适配体穿入牛奶样品捕获到四环素后，其自身发生变构，失去激发ThT的能力，因此穿出牛奶样品透明液滴内的ThT不再发光。封面清晰阐述了该传感器研发的核心：依靠功能核酸在加入靶标前后的变构效应，令结构特异性荧光分子响应信号变化，最终实现对食品样本中四环素的超灵敏检测。
硫*素T（ThT）作为常见荧光染料，被报道可与G-四链体中G-四平面的沟槽发生键合作用，引发光开关启动，实现对自身荧光的强激发，令G-四链体结构成为如今ThT信号输出的主流核酸结构模型。
功能核酸适配体是通过SELEX（指数富集的配体系统进化技术）筛选出来的由十几个寡核苷酸组成的DNA/RNA单链序列，可通过自身折叠成特定结构与小分子、离子、蛋白质、微生物等多种靶物质发生识别结合，具有相比抗体而言更低的免疫源性和细胞*性，同时可在体外大量合成，降低实验成本，为信号识别和检测创造新的机遇和突破。
因此研究设计思路为，对剪得到的8nt具有构成劈裂G-四链体潜力的四环素适配体序列进一步理性设计，在不改变碱基组成及排序的情况下，将单序列引入重复单元，形成以16nt双价四环素适配体为基础的新序列，赋予其更好的G-四链体形成能力，因为该结构可以更好地强激发ThT荧光。进一步，团队试图在此条件下，通过在双价适配体基序间隔间引入适当长度的碱基单元，促进序列能更易折叠形成稳定的G-四链体结构，从而在无靶标情况下，令ThT荧光信号有更优的输出，在引入靶标后，通过四环素与序列的高亲和性，破坏G-四链体形成条件，实现在靶标加入前后的构象变化，令ThT荧光不能被有效激发，最终基于ThT荧光信号前后响应差异实现对四环素的无标记传感（图1）。
图1四环素双价适配体非酶免标记传感器原理图
首先，研究通过对8nt四环素适配体序列的巧妙设计，获得了双价适配体间隔插入序列，分析8nt四环素适配体序列、双价适配体序列及双价适配体间隔插入不同碱基类型的序列之间的荧光强度可知，插入2G碱基的序列，相比四环素适配体序列和双价适配体序列，显著激发了ThT荧光(图2B)；因此，在确定G为最适间隔插入碱基的基础上，又对最适序列间隔插入碱基的数目进行了探究，荧光检测结果如图2B所示，双价-3G插入适配体序列相比于其他序列，荧光强度接近，是四环素适配体序列激发ThT的近40倍，双价适配体序列激发ThT的近14倍，故认为该序列具有最好的ThT荧光激发能力。
图2A：双价适配体间隔插入不同类型碱基的荧光强度；B：双价适配体间隔插入不同数量G碱基的荧光强度
随后，在双价-3G插入适配体检测四环素的可行性验证中(图3)，四环素加入前后ThT荧光响应变化侧面印证了因靶标与适配体序列结合，破坏G-四链体结构，使得ThT无法插入G-四链体平面，荧光激发被限制，从而降低检测荧光信号。
图3可行性验证确定序列后，由于传感器的荧光响应值及对靶标检测的灵敏度与实验体系及实验条件密切相关，为了令传感器获得最佳检测性能，在文章中分别对最适测量时间(图4A)、适配体序列与ThT反应体系浓度比(图4B)、四环素孵育时间(图4C)、缓冲液离子体系及离子浓度进行了优化(图4D、E)，并确定最适传感体系。
图4优化过程
最佳反应体系及实验条件下，通过荧光光谱呈现的ThT荧光强度变化确定传感器检测性能，如图5A所示，ThT荧光强度随四环素浓度增加而降低。选取nm处不加靶标条件下ThT荧光值与各四环素浓度下对应ThT值做差值，发现差值与四环素浓度的对数之间在10nmol/L-1μmol/L范围内呈现良好的线性关系（图5B），最低检测限（LOD）为96pmol/L。
图5传感器检测性能
研究选择了牛奶中易出现残留的5种抗生素：氨苄青霉素、林可霉素、氯霉素、庆大霉素、土霉素，评估传感器特异性，结果如图6所示，非靶标抗生素所产生的荧光强度变化远远小于靶标加入前后的数值变化程度，表明本传感器对四环素具有较高的选择性，即特异性良好。此外，为评估传感器对真实样品的适用性和可靠性，将传感器应用于牛奶样品中进行四环素检测，选择nm处不同四环素浓度牛奶样本中对应ThT的荧光值，分析带入标准曲线计算回收浓度，获得回收浓度与实际加标浓度之间的关系，最终确定该方法的回收率在.1%到.1%之间，即传感器的重现性及准确度较好。同时，整个实验可以在20min内完成，说明传感器具备了在实际牛奶样品中快速检测四环素的能力。
图6特异性评估
点评：
首次理性设计并获得四环素双价适配体序列，在保留其对四环素良好识别性能的同时，赋予序列在缓冲液中更好的G-四链体形成能力。
检测体系无需额外引入荧光标记或酶等荧光显色物质，免去复杂的操作和额外的成本，实现了对四环素的非酶免标记传感。
可实现在10nM-1μM的浓度范围内的四环素检测，检测限低至96pM；同时，对氨苄青霉素、林可霉素、土霉素、庆大霉素等几种常见抗生素均无显著非特异性信号变化，传感灵敏、特异性强。
可在20min内可实现对牛奶样品中四环素残留的快速检测，具有良好的实用价值，便于推广。
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