原文出处：BrunoSilva,RajikaArora,SilviaBioneClausM.Azzalin.TERRAtranscriptiondestabilizestelomereintegritytoinitiatebreak-inducedreplicationinhumanALTcells.NatCommun.Jun18;12(1):.
研究背景：
TERRA是端粒DNA转录的长的非编码RNA。TERRA分散在核质中，或者与端粒染色质以及其他含有或不含有端粒DNA重复序列的基因组位点相关联。介导TERRA在染色体上的分子机制仍需充分阐明；然而，TERRA与其模板DNA链（端粒R环）形成RNA：DNA杂交体，以及与端粒结合蛋白TRF1和TRF2的相互作用表明，TERRA与含端粒DNA位点的联系涉及RNA-DNA和RNA-蛋白的相互作用。TERRA参与了几个与端粒相关的过程，包括端粒酶的招募和调节、端粒DNA复制、端粒异染色质的建立、端粒DNA损伤的反应和复制性衰老的启动。作者也发现TERRA在端粒酶阴性癌细胞的端粒延长过程中激活了替代端粒延长(ALT)机制。ALT是一种特殊的修复途径，通过断裂诱导复制(BIR)修复受损端粒，这种途径发生在细胞周期的G2和M期，需要DNA聚合酶的亚基POLD3和POLD4。与TERRA在ALT中的功能一致，人类ALT细胞，包括U2OS，以端粒转录升高、TERRA水平升高和丰富的端粒R-loops为特征。此外，因为RNaseH1（RNA:DNA内切酶）和FANCM（ATP酶/解旋酶）的失活会增加端粒的不稳定性和ALT的活性，而它们的过表达会减少ALT，因此提出由ALT端粒的TERRA/端粒R环引发的生理性损伤可能为BIR介导的端粒延长提供底物。
人类TERRA的染色体来源是有争议的，之前报告了TERRA分子来自多个染色体末端。后来对TERRA进行分析以及分子和细胞生物学验证，认为人类TERRA主要是从20号染色体（20q）子染色体长臂上的一个独特基因座转录的，接下来使用CRISPR/Cas9敲除了U2OS骨肉瘤细胞中的20q子染色体片段，并分离出几个克隆系（20q-TERRAKO细胞）。与亲代细胞相比，20q-TERRAKO细胞的TERRA总水平大幅下降，这支持了所提出的TERRA的起源。
研究结果：
结果一：开发结合29bp重复序列的转录激活因子类效应器
为了评估TERRA转录对ALT细胞端粒稳定性的影响，设计了转录激活剂样效应器（TALEs），靶向29bp重复共识内的20bp序列（这里称为T-TALEs）。在20个子染色体的最后3kb内发现了精确的20bp序列（3p、5p、9p、12p、16p、19p、1q、2q、4q、5q、6q、10q、11q、13q、15q、16q、19q、21q、22q、和Xq/Yq）。T-TALEs在C端与强核定位信号（NLS）、mSIN3相互作用域的四个转录抑制域（增强型抑制域，SID4X）和人流感血凝素（HA）表位融合（Fig.1a），没有与SID4X融合的T-TALEs作为对照。转基因被克隆到多西环素（dox）诱导启动子的下游，并稳定地整合到表达四环素抑制蛋白的U2OS细胞中。在没有dox的情况下，分离出几个克隆细胞系，并先后通过westernblot和使用抗HA抗体的IF实验观察dox诱导的T-TALE表达。选择两个独立的SID4X融合的T-TALEs的细胞系（sid1和sid4）和两个未融合的T-TALEs的细胞系（nls1和nls3）进行进一步的实验，因为在没有dox的情况下，转基因的表达几乎是检测不到的；并且dox处理诱导的异位蛋白的表达均匀地分布在整个细胞群中，适当地定位在细胞核中，并且在四个细胞系中的水平相似（Fig.1a；Fig.S1a-c）。为了确认T-TALE的结合特异性，用dox处理nls3、sid4和亲代U2OS细胞24小时，用抗HA抗体进行Chips（染色质免疫沉淀），然后用寡核苷酸扩增几个染色体末端的子染色体序列，这些序列含有（29bp+）或不含有29bp重复序列（29bp-）。与亲代U2OS相比，在29bp+子染色体上(9p、10q、15q、16p和Xq)非常接近29bp重复序列的DNA在nls3和sid4ChIP中富集程度增加，而在同一子染色体上离29bp重复序列更远的序列中，富集程度却降低。相反，对于来自29bp-子染色体（10p、12q、18p、20q和Xp）、Xcen、Alph、ACTB、U6基因位点的DNA没有富集（Fig.1b），说明T-TALEs特异性地与29bp重复结合。
结果二：T-TALEs抑制含有29bp重复的染色体末端的TERRA转录
为了了解T-TALEs的功能，用dox处理细胞24小时，通过RT-qPCR分析29bp+（9pXq、10q、15q和16p）和29bp-（10p18p、12q、20q和Xp）子染色体的TERRA。在sid1和sid4细胞中，29bp+子染色体的TERRA减少，而29bp-的TERRA则不受影响。在nls1和nls3细胞中，在任何染色体末端都没有观察到TERRA水平的明显变化（Fig.1c）。通过FACS（荧光激活细胞分选）对细胞进行PI染色，与对照组相比，发现经dox处理的nls和sid细胞的细胞周期没有发生改变（Fig.S3a，b）；这表明在sid1和sid4细胞中观察到的TERRA减少不是细胞周期紊乱的结果。进一步支持这一观点的是，在ALT细胞中，当细胞周期从S期进展到G2期时，TERRA水平并没有减少，而这在端粒酶阳性细胞中是很典型的。因此，TALE可以抑制TERRA从29bp启动子重复的转录。
Fig.1
Fig.S1
Fig.S3
结果三：抑制TERRA转录可缓减端粒不稳定性
为了探究抑制TERRA转录对端粒稳定性的影响，使用针对单链DNA结合蛋白RPA32、在丝氨酸33处磷酸化的RPA32（pSer33）和γH2AX的抗体，其中RPA32和pSer33是DNA复制压力的标志物，而γH2AX是DNA损伤标志物。作者通过端粒DNAFISH实验和对结合蛋白成分TRF2的IF实验分析发现，dox处理24小时就减少了sid1和sid4细胞中RPA32的端粒定位，并且下降了γH2AX与端粒共聚焦的频率。与pSer33相比，总的RPA32的下降幅度很大，这表明有一部分蛋白独立于丝氨酸33的磷酸化而与端粒结合，或者该蛋白在与端粒结合的同时经历了去磷酸化。dox处理没有改变nls1和nls3细胞中任何标记物的共聚焦频率（Fig.2a，b;Fig.S4）。因此，在sid1和sid4细胞中观察到的所有变化不是由于蛋白质细胞水平的改变或DNA损伤反应的损害。
Fig.2
Fig.S4
结果四;抑制TERRA转录会抑制ALT活性
根据模型，端粒不稳定性的减弱应该是削弱了ALT的活性。为了验证这一点，作者首先通过结合抗PML抗体的IF和端粒DNAFISH来量化ALT相关的PML体（APBs）。加入dox后24小时，sid1和sid4细胞中的APBs减少，而nls1和nls3细胞中的APBs没有减少。然后使细胞在G1/S过渡期同步化，在dox和Cdk1抑制剂RO-存在下从S期进入G2期，之后用EdU处理细胞，并将EdU检测与端粒DNAFISH相结合，在nls1和nls3细胞中，dox不影响EdU与端粒DNA共定位的频率，而在sid1和sid4细胞中则大大降低了这些频率，这表明dox处理减少了G2同步的sid细胞的端粒BIR。同样dox减少了sid1和sid4中POLD3与结合蛋白成分RAP1共定位的频率，但在nls1和nls3G2细胞中没有（Fig.3a，b；Fig.S4）。因此，在sid1和sid4细胞中观察到的ALT特征的下降不能归因于蛋白质水平的改变或处于G2期的细胞比例的差异。作者还对ALT活性的其他特征比如C环（富含C的环状端粒DNA分子）以及端粒姐妹染色单体交换（TSCEs）进行了分析，在nls1、sid1和sid4细胞中，用总基因组DNA进行的C环检测没有发现变化，在nls3细胞中，C环在处理24小时后减少，在以后的时间点开始恢复（Fig.S5a，b）。在nls3和sid4的染色体上进行CO-FISH检测没有发现与dox处理相关的TSCE频率的变化。然而，在几个染色体末端的前导链和滞后链出现了不一样的信号分布。因此，作者通过分析有两条领先链和一条滞后链信号（DLead）和有两条滞后链和一条领先链信号（DLagg）的TSCEs，结果发现在两个细胞系中，DLagg端粒不受dox处理的影响；而与未经处理的对照组相比，DLead端粒在sid4而不是nls3dox处理的细胞中减少了一半以上（Fig.4a-c）。
Fig.3
Fig.4
Fig.S5
结果五：抑制TERRA转录会损害端粒的维持
由于ALT活性的减弱会导致端粒伸长受损和端粒DNA的逐渐丧失。所以作者用dox处理细胞，并通过端粒DNAFISH实验分析端粒。在用dox处理长达15天和9天的sid1和sid4细胞中分别观察到端粒自由末端（TFEs）的积累，而在nls3细胞中没有观察到端粒自由端有明显的变化（Fig.5a，b）。作者还通过TRF（端粒限制性片段分析）和PFGE（脉冲场凝胶电泳）检查了用dox处理15天的nls3、sid1和sid4细胞的端粒状态。在比较经dox处理和未经处理的细胞时，没有观察到大量端粒的长度（由10至63.5kb组成）或相关的信号强度的差异（Fig.S6），这表明由TERRA转录抑制诱导的TFEs大多聚集在较短的端粒上，这在PFGE中是检测不到的。这与较短的端粒具有较高的转录活性从而主要受到其抑制的影响是一致的。然后通过削弱ALTBIR机制观察在dox处理的sid1和sid4细胞中是否出现同样的端粒缺陷，作者用两个独立的siRNAs在U2OS细胞中耗尽POLD3，持续6天（Fig.S1d），并进行端粒DNA荧光定量分析。与siRNA对照转染的细胞相比，POLD3的耗竭使TFE频率增加了近3倍（Fig.5a,b）。因此通过抑制TERRA转录或耗尽POLD3会损害BIR进而在短时间内造成端粒DNA的大量损失。
Fig.5
Fig.S6
结果六：抑制TERRA转录导致转录组的变化
因为小鼠ES细胞中TERRA的耗竭会引起基因表达的明显变化，因此，对nls3和sid4细胞用dox处理72小时或不处理的总RNA进行了RNA-seq分析，通过比较发现sid4细胞中个转录物（个蛋白编码转录物和个非编码转录物）的表达有明显的差异；在这些转录物中，个被上调，个被下调；而在用dox处理的nls3细胞中，只有15转录物（13个蛋白编码和2个非编码）的表达有差异（Fig.6a）。因此，抑制TERRA的转录与ALT细胞中转录组变化有关。GO-BP（基因本体论生物过程）分析确定了在个GO-BP术语中明显富集的转录物的改变，并和12个主要的生物过程有关，包括神经系统发育、细胞运动、细胞周期进展和细胞死亡（Fig.6b）。还观察到参与液泡组织和自噬的转录物明显上调，而参与细胞凋亡的转录物则下调（Fig.S7）。参与DNA代谢的转录物的差异性表达，并确定了11个蛋白编码转录物（下调的有：ORC1,RAD51AP1,BRCA2,GEN1,ORC6,BRCA1,HROB,BLM,EXO1,FANCD2；上调的有：LIG4），其表达的改变可以减轻端粒不稳定性和ALT活性（Fig.6a）。但通过Westernblotting对用dox处理0、24和72小时的nls和sid细胞的总蛋白进行了定量分析发现在sid1和sid4细胞中，任何时间点都不能检测到蛋白质水平的改变（Fig.6c）。这证实了抑制TERRA的转录会影响SID4X融合的T-TALEs对端粒稳定性和ALT活性的作用。
Fig.6
Fig.S7
研究结论：
1.抑制TERRA的转录可以减少DNA复制压力和端粒DNA损伤的标志（RPA32和γH2AX），并损害了ALT活性和端粒长度的维持，导致TFE生成。
2.TERRA转录在ALT细胞中可以破坏端粒的完整性，从而引发BIR来促进端粒的延长。
3.抑制TERRA的转录，比如通过对TERRA启动子活性的化学抑制，或许可以成为选择性杀伤ALT癌细胞的新型治疗策略。
校对：张宇宁
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