无细胞生物传感是一种低成本，易于使用和现场部署的诊断技术平台，可以检测一系列与人类和环境健康相关的化合物。无细胞生物传感器核心主要由两层组成：基于RNA或蛋白质的生物传感层和报告基因构建体输出层。通过连接这些层，当目标化合物与生物传感器结合并激活报告基因表达时可产生信号（图1）。然而，现有的无细胞生物传感器通常缺乏信息处理层，无法进行多样化、复杂的信息处理。JuliusB.Lucks团队开发了一个可通用的信息处理层，以构建允许微调反应动力学的混合RNA-DNA电路，利用toehold介导的DNA链置换(TMSD)来增强和扩展ROSALIND的功能，可以解决无细胞生物传感器信息处理的弊端，实现在体外处理分子信息的功能。
图1无细胞生物传感器通常在目标化合物（输入）与蛋白质转录因子（传感器层）结合时激活，该蛋白质转录因子被配置为激活报告构建体（输出层）的表达。这导致产生可检测的信号，例如荧光。在信号生成前添加下游信息处理层，可以通过添加逻辑处理和信号比较等计算功能来增强无细胞生物传感器的性能和扩展功能。在这里，这是通过连接生物传感输出层来实现的，以产生能够激活产生信号的toehold介导的链置换电路的单链RNA
该团队首先验证TMSD是否与体外转录兼容。实验中设计了一个DNA门，其中一条链用荧光团标记，另一条链用猝灭剂标记。实验表明，单链RNA（InvadeR）能够顺利置换DNA门的淬灭剂团链，实现荧光基团链发光产生信号。此外还证实在DNA信号门存在情况下原位转录InvadeR以产生信号。随后对整个体外转录与TMSD结合进行优化，主要通过优化DNA门设计实现（图2）。该团队设计了5种不同的InvadeR变体（图2a），随着变体3插入碱基的增多，其二级结构变得不稳定，但其链置换产生的荧光信号逐渐增强（图2b）。随后该团队测试了原位转录变体的TMSD反应动力学，观察到变体3可产生最快荧光激活速度（图2c-f）。实验表明，优化InvadeR的设计可实现快速信号生成。图2InvadeR的二级结构影响TMSD效率
接着用aTF调节InvadeR的转录，以创建使用TMSD输出的无细胞生物传感器。将前期构建好的检测四环素模板与InvadeR结合，在T7启动子与tetO结合位点之间插入不同长度的spacer，获得最佳信号输出模板（间隔2bp）（图3a-b）。使用四环素对无细胞生物传感器进行诱导，证实转录出的InvadeR能够成功置换猝灭基团链（图3c-d）。之后该团队与前期RNA荧光适配体报告元件实验进行对比，证实InvadeR-DNA链置换体系具备更快的信号响应，仅在10min内即可激活可见荧光（图3e-f）。后续该团队也针对不同的aTF设计优化InvadeR，构建了能够检测柚皮素（TtgR）、Zn2+（SmtB）的生物传感器模板。图3aTF调节InvadeR转录
级联TMSD电路可以用于编辑逻辑电路。基于几种不同aTF设计了一系列逻辑门，包括NOT、AND、OR（图4）。以OR门为例，在T7启动子调节下分别嵌合转录因子结合位点和相应InvadeR。转录出的RNAinputs能够分别链置换对应DNAORgates。被置换出的链通过级联可置换下DNAsignalgate的荧光基团链，获得信号响应（图4a-b）。通过计算能准确表达出OR门输出四环素和Zn2+相对应信号。图4使用级联TMSD电路执行逻辑计算
级联TMSD电路的组件可进行分层执行更复杂的逻辑计算，包括NOR，NAND，IMPLY和NIMPLY（图5）。以NOR门为例，在T7启动子调节下分别结合aTF位点、Spacer和相同的Inverter。另外再设计一个T7启动子调控的组成型InvadeR。当体系中同时不存在四环素和Zn2+时，InvadeR可链置换DNAsignalgate的猝灭基团链发出荧光。只要其中存在两种靶标之一，诱导后转录出的RNA即可与InvadeR结合消耗，不再发生链置换激活荧光（图5a）。图5逻辑组件分层允许更复杂的计算
最后该团队使用TMSD电路量化实际检测的生物传感器（图6）。为了应用于实际检测调节检测阈值，该团队设计了另一个未标记的DNA阈值门，可以以更快的速度消耗转录出的InvadeR。不同浓度的DNA阈值门消耗InvadeR的时间不同，根据时间差可计算出检测物质的浓度（图6b-c）。另外可采用ADC电路模拟信号后使用生物传感器对样本进行验证（图6d-e）。图6TMSD电路量化实际检测的生物传感器
点评：
1.TMSD电路可以与体外转录连接，作为无细胞生物传感器的信息处理层。
2.TMSD输出的速度显着提高了信号生成速度，检测时间不到10分钟。
3.结合TMSD的计算能力，将多个RNA-DNA门分层，以构建12个不同的电路，以模块化方式实现七种不同的逻辑功能。
4.RNA-DNA设计思路值得借鉴，可利用级联的思路扩大核酸电路生物传感器的信号。
5.Toehold的长度能够调整整体反应的速度，适合一些具备输出动力学差异的靶标。
6.整体思路可以开发多路复用型生物传感器。
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