1.微生物的分离和培养
（1）培养基的类型和营养构成
（2）常用的消*和灭菌方法
（3）牛肉膏蛋白胨固体培养基制备的基本步骤
（4）纯化大肠杆菌的方法（平板划线法和稀释涂布平板法)
2.某种微生物数量的测定
（1）土壤中分解尿素的细菌的计数方法
（2）土壤中分解纤维素的细菌的计数方法
3.培养基对微生物的选择作用
（1）分解尿素的细菌分解尿素的原理
（2）怎样从土壤中分离出分解尿素的细菌
（3）分解纤维素的细菌分解纤维素的原理
（4）如何筛选纤维素分解菌
串联导思2夯实基础3一、微生物的培养
1．培养基。
(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
(2)营养构成：一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。此外还需要满足微生物生长对pH、氧气以及特殊营养物质的要求。
(3)①种类：按照物理性质可分为液体培养基和固体培养基。
②下表为某微生物培养基的成分。
该培养基中可以为微生物提供碳源的是葡萄糖，此培养基为固体培养基，因此培养基中加入了琼脂。
2．无菌技术。
(1)关键：防止外来杂菌的入侵。
(2)不同对象的无菌操作方法(连线)：
方法
类型
对象
①灼烧灭菌Ⅰ接种针(环)
②干热灭菌a．消*
③巴氏消*Ⅱ培养皿
④紫外线b．灭菌
⑤化学药物Ⅲ操作者双手
⑥高压蒸汽
灭菌Ⅳ水源地
答案：①—b—Ⅰ②—b—Ⅱ③、④—a⑤—a—Ⅲ、Ⅳ⑥—b
3．大肠杆菌的纯化培养。
(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基。
(2)纯化大肠杆菌的方法。
①纯化培养原理：想方设法在培养基上得到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的菌落，即可获得较纯的菌种。
②纯化大肠杆菌的关键步骤：接种。
③常用的微生物接种方法有两种(如图)：
a．平板划线法，如上图甲：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
b．稀释涂布平板法，如上图乙：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
(3)菌种的保藏方法。
①对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。
②对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。
二、微生物的分离与计数
1．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数。
(1)分离原理。
土壤中细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。
(2)统计菌落数目。
统计样品中的活菌一般用稀释涂布平板法。
(3)实验流程。
土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察→细菌的计数。
2．分解纤维素的微生物的分离。
(1)纤维素酶。
①组成：纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。
(2)纤维素分解菌的筛选。
①原理。
②筛选方法：刚果红染色法，即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
③培养基：以纤维素为唯一碳源的选择培养基。
④实验流程。
考点精讲3考点一 微生物的实验室培养与计数
1．识记并补充下表中培养基的重要成分
营养物质
含义
作用
主要来源
碳源
能提供碳元素的物质
构成生物体的物质，异养生物的能源物质
无机物：CO2、NaHCO3；
有机物：糖类、脂肪酸、石油、花生粉饼等
氮源
能提供氮元素的物质
合成蛋白质、核酸以及含氮代谢产物
无机物：N2、NH3、氨盐、硝酸盐；
有机物：尿素、牛肉膏、蛋白胨等
生长因子
生长必不可少的微量有机物
酶和核酸的成分
维生素、氨基酸、碱基等
水
细胞生命活动必不可少的物质
不仅是良好的溶剂，还是结构物质
培养基、大气、代谢产物
无机盐
提供除碳、氮元素以外的各种重要元素，包括某些大量元素
细胞内的组成成分，生理调节物质，某些化能自养型细菌的能源，酶的激活剂
培养基、大气
2.两种纯化细菌的方法比较
项目
优点
缺点
适用范围
平板划线法
可以观察菌落特征，对混合菌进行分离
不能计数
适用于好氧菌
稀释涂布平板法
可以计数，可以观察菌落特征
吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延
适用于厌氧菌和兼性厌氧菌
3.平板划线操作三个易错点
(1)灼烧接种环之后，要冷却后再进行取种，以免温度太高杀死菌种。
(2)划线时最后一区域不要与第一区域相连。
(3)划线用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破。
考点二 微生物的筛选与计数
1．两种菌株筛选实例的比较
土壤中分解尿素的细菌
分解纤维素的微生物
①选择培养基的成分：尿素作为唯一的氮源
②鉴定方法：在培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，pH升高，说明细菌能分解尿素
①选择培养基的成分：纤维素作为唯一的碳源
②鉴定方法：刚果红染色法，即刚果红与纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，培养基出现以纤维素分解菌为中心的透明圈
2.掌握筛选微生物的三种方法
(1)单菌落挑取法：利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体平板培养基表面，直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物。
(2)选择培养法：利用选择培养基对微生物进行选择培养，直接获得目的微生物。
(3)鉴定培养法：利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现特有的特征，然后筛选目的微生物。
3．统计菌落数目的方法
(1)显微镜直接计数法。
①原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。
②方法：用计数板计数。
③缺点：不能区分死菌与活菌。
(2)间接计数法(活菌计数法)。
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
②计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。
③操作：设置重复组，增强实验的说服力与准确性。同时为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～的平板进行计数。
4．设置对照
(1)目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
(2)方法：①证明培养基未被污染，用空白培养基作对照。②证明选择培养基的筛选作用，用牛肉膏蛋白胨培养基接种等量同种菌液作对照。
易混易错4微生物计数的三个易错点
1．为了使结果接近真实值，应设置三个或三个以上的平板，计算出菌落平均数。
2．计算时明显偏离实际值(本组实验其他平板计数值)的要舍弃掉后求平均值。
3．对照实验的设计首先要明确设计的目的，分析出实验的自变量之后才能准确设计。
方法技巧1.选择培养基的配制
(1)利用某一类微生物的特殊营养要求配制培养基。如培养基中缺乏氮源时,可以分离出固氮微生物;以尿素为唯一氮源的培养基可分离出分解尿素的微生物等。
(2)利用某一类微生物的化学抗性配制培养基。如培养基中加入四环素,可以分离出对四环素具有抗性的微生物等。
(3)利用某一类微生物的物理抗性配制培养基。如改变微生物的培养条件,将培养基放在高温环境中培养,可以分离出耐高温的微生物等。
要语强记51.培养基有液体培养基、固体培养基（含凝固剂）和半固体培养基三种类型。
2.培养基中一般都含有水、碳源、氮源和无机盐四种成分。在配制培养基时，除满足营养需求外，还应考虑pH、氧气及特殊营养物质的需求。
3．无菌技术包括消*和灭菌。消*是使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包括牙孢和孢子），常用的方法有：煮沸消*法、巴氏消*法、化学药剂消*法。灭菌是使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括牙孢和孢子。常用的方法有灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌。
4．制备固体培养基的流程是：计算→称量→溶化→灭菌（成败最关键的一步）→倒平板。倒平板的目的是防止培养皿盖上的水滴滴入培养基造成污染。
5.纯化微生物的方法有：平板划线法和稀释涂布平板法。平板划线法要求多次划线,稀释涂布平板法要求菌液要充分地稀释。
6.只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。筛选分解尿素的细菌应以尿素作为培养基中的唯一氮源。
7.测定微生物的数量常用稀释涂布平板法（活菌）和显微镜直接计数法。微生物的计数要求制作多个平板,且每个平板上能长出30～个菌落的方可作为计数依据。
8.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，则可以初步鉴定该种细菌能够分解尿素。
9.纤维素酶是一种复合酶，包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶。前两种酶将纤维素分解为纤维二糖，第三种酶再分解为葡萄糖。
10.尿素分解菌和纤维素分解菌的分离都运用了选择培养基,前者所用的培养基中尿素是唯一的氮源,后者所用的培养基中纤维素是唯一的碳源。
重点精讲61、培养基的配制
2、微生物的实验室培养
3、土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
教材旁栏问题和课后习题答案课题1微生物的实验室培养
（一）旁栏思考题
1．无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？
答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。
2．请你判断以下材料或用具是否需要消*或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。
（1）培养细菌用的培养基与培养皿
（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管
（3）实验操作者的双手
答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消*。
（二）倒平板操作的讨论
1．培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？
提示：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
2．为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
3．平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
4．在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。
（三）平板划线操作的讨论
1．为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
2．在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
答：以免接种环温度太高，杀死菌种。
3．在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
（四）涂布平板操作的讨论
涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？
提示：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。
（五）练习
1．提示：可以从微生物生长需要哪些条件的角度来思考。例如，微生物的生长需要水、空气、适宜的温度，食品保存可以通过保持干燥、真空的条件，以及冷藏等方法来阻止微生物的生长。
2．提示：可以从这三种培养技术的原理、操作步骤等方面分别进行总结归纳。例如，这三种培养技术都需要为培养物提供充足的营养，但无土栽培技术的操作并不需要保证无菌的条件，而其他两种技术都要求严格的无菌条件。
课题2土壤中分解尿素的细菌的分离
一．研究思路
(一）筛选菌株
微生物的选择培养，是指利用培养基的组成使适宜生长的特定微生物得到较快繁殖的技术，也称为微生物的“选择培养”。在本课题提供的选择培养基的配方中，尿素是培养基中的惟一氮源，因此，原则上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能够在选择培养基上生长的微生物不一定是所需要的微生物，还需要进一步的验证。
(二）统计菌落数目
统计菌落数目的理论依据是：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在30～的平板进行计数。
（三）设置对照
A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。实验方案有两种。一种方案是可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。另一种方案是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。
二．课题成果评价
（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落
对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。
（二）样品的稀释操作是否成功
如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。
三．练习
2．提示：反刍动物的瘤胃中含有大量的微生物，其中也包括分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基外，还应参照厌氧菌的培养方法进行实验设计．
课题3分解纤维素的微生物的分离
（一）旁栏思考题
1．本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？
答：本实验流程与课题2的流程的区别如下。课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为惟一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。
2．为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？
答：由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。
3．将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？
答：将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将纸埋于深约10cm左右腐殖土壤中。
4．想一想，这两种方法各有哪些优点与不足？你打算选用哪一种方法？两种刚果红染色法的比较
方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。方法二的另一缺点是：有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。
5．为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？
答：在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。
（二）练习
2．答：流程图表示如下。
土壤取样→选择培养（此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定）→梯度稀释→将菌悬液涂布到有特定选择作用的培养基上→挑选单菌落→发酵培养
特别说明：参考文献为高中生物金版高考总复习，思维导图内容来源于本届优秀高三学生亲自手画的原创思维导图（可任选一张认真学习），其它内容来源于网络。
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