“颜宁老师在胆固醇代谢调控这一研究领域已经持续深耕近二十年，如此长的时间跨度，可见这个课题的难度非同一般，因此，最终这次能够取得成果真的十分不容易。”谈及最近发表的论文，西湖大学生命科学学院博士后鄢仁鸿这样告诉DeepTech。
近日，普林斯顿大学教授颜宁、清华大学结构生物学高精尖中心研究员闫创业、鄢仁鸿等人携团队进行合作，首次对25HC存在下的人源Scap（SREBPcleavage-activatingprotein）和Insig-2（Insulin-inducedgene-2）复合物进行了冷冻电镜分析，跨膜（TM）结构域的平均分辨率为3.7，并对Scap中的甾醇感受结构域（Sterol-sensingdomain，SSD）和Insig-2中的全部6个TMs进行解析，首次发现25HC分子结合在Scap的S4-S6段和Insig-2的TMs3/4段之间形成的空腔上，Scap-S4中间部分的解旋对25HC及Insig结合起到非常关键的作用。
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相关论文（来源：Science）
相关论文于1月14日发表在Science上，标题为《受固醇调控的人源Scap与Insig-2相互作用的结构》（AstructureofhumanScapboundtoInsig-2suggestshowtheirinteractionisregulatedbysterols），论文共同第一作者为鄢仁鸿以及清华大学博士生曹平平、宋闻麒。
对于该成果，鄢仁鸿表示：“这是胆固醇代谢调控的核心部分，我们将它的结构解析出来，就能让人们进一步弄清楚这一过程究竟是怎样发生的，让后续的药物设计更加‘有的放矢’，也就是能够精准有效地抑制或者激活胆固醇的合成过程，从而治疗胆固醇代谢异常导致的一些疾病。”
据悉，目前临床上用于降低胆固醇尤其是低密度脂蛋白-胆固醇（LDL-C）的药物主要是他汀类，这类药物虽然效果显著，但副作用同样明显，例如，会对肝脏、胃肠道、皮肤和骨骼肌带来影响，尤其是用药剂量特别大的患者可能会产生肌痛、肌病以及罕见的横纹肌溶解。
要让用药的靶点更加精准，进一步提高治疗效果，同时尽量减少副作用，就离不开对人体胆固醇代谢调控通路的具体作用机制的掌握，而这正是本次研究的重要性所在。
揭示胆固醇代谢的负反馈调控机制
据论文报道，胆固醇这种代谢小分子是人体细胞膜的重要组成部分。为控制胆固醇小分子，高等哺乳动物逐渐进化出一套非常精密的负反馈调节机制——固醇调节元件结合蛋白（Thesterolregulatoryelement-bindingprotein，即SREBP）通路控制甾醇的细胞内稳态。该通路中的关键分子Scap和Insig-1/2是膜内嵌入的固醇传感器，而25-羟基胆固醇（25-hydroxycholesterol，即25HC）依赖的Scap和Insigs的结合则是SREBP通路的主开关。
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SREBP通路控制甾醇的细胞内稳态（来源：Science）
简单来说，就是膜结合转录因子SREBP-2调节胆固醇代谢，Scap和Insig之间的联系需要胆固醇或是胆固醇衍生物25HC。
当人体细胞内的胆固醇水平升高到一定阈值时，SREBP-2/Scap复合物通过Scap-SSD与胰岛素诱导基因Insig-1或2的相互作用被固定在内质网（ER）膜上，让SREBP-2无法被激活从而阻止胆固醇进一步的吸收与合成。
当细胞的胆固醇水平降低时，Scap-SSD不再与Insig-1/2相互作用，SREBP-2/Scap复合物通过COPII包被的囊泡从内质网运输到高尔基体，在那里SREBP-2经历两次连续的蛋白酶切割。SREBP的N端结构域能够进入到细胞核调控下的胆固醇合成相关的基因表达，从而使人体的胆固醇水平得到增加。
虽然该通路早在20多年前就被发现，但对该结构的阐明却明显落后于细胞和生化的特征。并且，此前对该通路的结构认识主要来自分枝杆菌或酵母等低等生物的同源蛋白，很长一段时间以来，人们对25HC结合位点以及SSD和Insig之间的结合作用机制仍不清楚。
“我们此次的工作主要就是结合生物化学和冷冻电镜技术，解析人源Scap与Insig-2如何受到胆固醇衍生物25HC调控的结构。”鄢仁鸿说道。
三明治结构：25HC夹在Scap-SSD和Insig-2之间
他们利用生化和冷冻电镜技术进行解析发现，Scap和Insig-2之间的相互作用在接触有限的情况下表现为高度不对称。
从腔内看，Scap的S2、S4、S6、S5与Insig-2的3/4TMs相互作用形成一个凹面。Insig-2主要利用TM3对Scap的S2和S4a进行封装。Insig-TM1的管腔端也与Scap-S2接触。在膜的另一侧，主要通过结合的25HC分子进行相互作用。
在高分辨密度下，可以从25HC的线状尾部分辨出甾醇主链，其特征为对应C18和C19基团的两个凸起将3β-OH基团留在管腔侧。Scap和Insig之间有限的接触形成了与结合配体连接的细胞质面腔。
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25HC介导Scap与Insig-2的相互作用（来源：Science）
并且，25HC与Scap倾斜的S4a几乎平行，四环插入到由Scap的S4a、S5、S6和Insig-2的TMs3/4包围的疏水口袋中。为了验证在结构中观察到的25HC的定位，他们试图引入与25HC结合但不涉及蛋白直接接触的Scap和Insig残基突变。
该团队选取三个残基进行检测发现，在没有25HC的情况下，Scap（DA）仍能与Insig结合，但25HC存在时，Scap与Insig的相互作用更强。当这三种突变均与Scap（DA）结合时，不加入25HC对复合物的形成仅造成轻微影响，SREBP激活实验也进一步印证了25HC的结构阐明结合位点。
Scap-S4的不连续性是Insig结合的关键
S4从中间解旋是Scap的一个显著特征，可作为Insig结合的开关。一方面，Scap-S4中间的弯曲以及S4a的倾斜在Scap和Insig之间形成容纳25HC的空腔。另一方面，ScapS4解旋为Insig-2的TM3上的Arg和Scap的S2上的Tyr的庞大侧链提供了空间。
此前有研究表明，Insig-2（RA）并没有对25HC所依赖的SREBP切割的抑制产生影响。此次在pulldown实验中，该突变轻微削弱了25HC介导与Scap间的关联。通过对结构进行分析，发现Arg可能与Scap-Glu以及Lys相互作用，Lys是Insig-2中TM3和TM4之间的连接位点。
为了验证它们之间潜在的相互作用，该团队检测了更多的突变体蛋白。然而Insig-2（KA）在25HC依赖的Scap结合方面与WT表现相似，Scap的EA破坏了25HC介导的与Insig-2的相互作用。当Lys和Arg都被Ala取代时，复合物可能无法在25HC存在的情况下形成，表明这两个碱基与Scap-Glu的相互作用对维持复合物形成的重要性。
如果与其他含有SSD的蛋白相似，一段完整的Scap-S4会使Insig-Arg（亲水残基）处于不合适的疏水环境中，从而阻碍与Insig的相互作用。当解旋点Gly突变为残基Ala时，Ala相比Gly来说更有利于形成完整的α螺旋，因而突变体Scap（GA）不能与Insig-2形成25HC介导的复合物，由此印证了Scap-S4的不连续性在复合物的形成中起到的关键作用。
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Scap-S4解旋的重要作用（来源：Science）
在疏水脂质双分子层中，如果不够稳定，那么TM螺旋在中间解旋将是十分不利的。25HC结合和附近的残基都会对中断螺旋的稳定性有影响。而S4a的倾斜是产生甾醇结合位点所必需的，将甾醇插入空腔又可以稳定扭结。另外，S2上的Tyr通过H键与Leu外露的主链酰胺结合来稳定解开的螺旋。Scap（YC）是一个特征明确的功能缺失（Lossoffunction，LOF）突变体。为了研究其羟基基团在稳定的S4扭结中的重要性，该团队构建了一个突变体Scap（YF），与YC类似，在25HC存在的情况下无法与Insig-2相互作用。
另一方面，S4解旋为Scap（DA）的功能获得（Gainoffunction，GOF）提供了一个可能的解释。S4解旋时Asp处于疏水残基构成的环境中，这种环境不利于维持S4的解旋状态。当Asp突变成中性的Ala时，则会倾向于稳定S4的解旋状态。
这一分析不仅为Scap（DA）的GOF提供了分子解释，在没有25HC的情况下，S4的展开构象可能更有利于与Insig的结合，而且还预测了附近的QA可能具有类似DA的功能。进一步的实验表明，突变体Scap（QA）可以在没有25HC的情况下与Insig形成复合体，但程度小于Scap（DA）。综上所述，过去已经发表的研究成果以及此次结构衍生的LOF和GOF突变支持了S4的不连续性在Insig结合中发挥的作用。
首次将跨膜区平均分辨率提升至3.7
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鄢仁鸿
“事实上，这是我在追随颜宁老师攻读博士学位之后开展的第一个课题，毕业后加入西湖大学，在此期间，也一直在跟进这个课题。就我个人而言，为这个课题累计花投入了七年时间，而颜老师在这个课题上付出的时间和精力更是远甚于我。原因就在于首先它是一个动态的调控过程，蛋白质本身的性质并不稳定，所以我们需要设计非常多的表达方案让蛋白稳定下来，然后才能进行后来的结构解析过程。而在之后的结构解析过程中，闫创业老师则作为真正的专家，做了非常多的尝试后，才解析出如此高分辨率的结构，为这次研究取得突破性成果做出了很大贡献。”鄢仁鸿表示。
事实上，人们之所以迟迟无法观察到这些关键蛋白的精细结构，很大程度上是受到电镜分辨率的限制，专攻小分子膜蛋白电镜结构解析的闫创业团队对算法进行了全面的改进——在张显微照片中，对高达.88万个蛋白颗粒进行多轮分类、提取、生成初始模型，在两轮多维参考分类后得到,个蛋白颗粒，再次进行非均匀细化，然后以4.2的平均分辨率进行重建。经聚焦细化后，首次将TM区域的平均分辨率提高到3.7，清晰地显示了Scap/Insig复合物跨膜（TM）域核心区域的二级元素和侧链的特征。
“我们此次研究解析的关于蛋白Scap和Insig如何受到25HC调控的分子机制，可以说初步填补了这一块的空白，为人们进一步深入了解胆固醇代谢调控奠定了基础。”鄢仁鸿说道。